基因工程操作流程.ppt

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1、为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序（consensussequence)，只有少数几个核苷酸的差别。终止子能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区:非编码区:原核细胞的基因结构有调控作用，含启动子、终止子等。非

2、编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子（二）真核细胞的基因结构(补)编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码1.2基因工程的基本操作程序①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒

3、转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因——主要指编码蛋白质的结构基因,也可以是一些具有调控作用的因子。取出DNA用限制酶切断DNA目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。1.目的基因的获取基因文库的种类：基因组文库：含有一种生物所有的基因部分基因文库：含有一种生物的一部分基因（如：cDNA文库）获取目的基因的方法一：从基因文库中获取目的基因基因文库（genelibrary）的概念：将含有某种生

4、物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。组织或细胞染色体DNA限制性核酸内切酶DNA片段重组DNA分子含重组分子的转化菌载体受体菌基因组文库存在于转化细菌内，由载体所携带的所有基因组DNA的集合。mRNA逆转录酶cDNA双链cDNA重组DNA分子载体含重组分子的转化菌受体菌用某种生物发育的某个时期的mRNA制备双链的cDNA后，建立的基因文库。cDNA文库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）无有基因多少

5、某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以PCR(polymerasechainreaction)——多聚酶链式反应是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取目的基因方法二：利用PCR技术扩增目的基因PCR扩增仪原理：DNA双链复制反应过程：1.变性：将反应系统加热至90℃-95℃，使模板DNA完全变性成为单链；2.退火：将温度下降至55℃-60℃左右，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸：将温度升至70℃-75℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经25～3

6、0次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。反应体系：模板DNA、特异性引物、耐热DNA聚合酶、dNTP及缓冲液利用PCR技术扩增目的基因DNA合成仪过程：适用范围：已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成获取目的基因方法三：化学合成法小结:目的基因的获取：三种方法(1)从基因文库中获取适用于目的基因序列为未知的情况(2)利用PCR技术扩增适用于目的基因的序列为已知的情况(3)人工合成适用于目的基因不是很大且其序列是已知的基因表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因等标记基因：鉴别受体细胞中是

7、否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。2、基因表达载体的构建常用的受体细胞动物、植物、微生物转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。3、目的基因导入受体细胞1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法转化方法2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术3）将目的基因导入微生物细胞常用CaCl21）将目的基因导入植物细胞常用方法：---农杆菌转化法适用范围：双子叶植物和裸子植物转化过程：1）将目的基因导入植物细胞——基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是籍高速度运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分