资源描述：
《抗细菌转基因工程课程资料ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、主讲人：李立志第三小组成员:李立志、李小强、李瑜转Rxo1基因抗细菌性条斑病水稻水稻细条病的发现水稻细菌性条斑病(简称细条病)由XanthomonascamPestrispv.Oryzicola（简称Xoc）引起。最早在1918年由Reinking首次报道了菲律宾水稻上发生细条病,在我国范怀忠等(1957)于20世纪50年代在广东省首先发现该病害。开始时误认为是白叶姑病，后经方中达等(1957)将该病与白叶枯病区分开来’确认为一种新的由细菌性病害。病菌特点该病菌属黄单胞杆菌属细菌,生长最适温28-30°C。低于16°C基本不发病。细条病的发生初侵染源主要有稻种、稻草和自生稻带菌,但也不排
2、除野生稻、李氏禾的交叉传染。病原菌主要从伤口侵入,菌脓可借风、雨、露等传播后进行再侵染。高温高湿等有利于病害发生。台风暴雨造成伤口,病害容易流行。偏施氮肥,灌水过深加重发病。水稻细条病的发病特点危害水稻的主要特点:主要侵害水稻叶片,病斑初呈暗绿色水橫状半透明小斑点,后逐渐沿叶脉方向扩展,成黄褐色,干结后呈黄色树胶状小粒,形如虚线,不易脱落。发病严iR吋,条斑融合成不规则的黄褐色至枯白色大斑块,外观与白叶枯病有些相似,但对光观察,病斑呈半透明状。病害流行时,叶片卷曲,完全呈一片白色。该病在水稻生长前期、后期都易感染,苗期症状较白叶枯病明显;病害严重时能引起稻株早期死亡或不能抽穂。即使能够抽
3、穗结实,但批谷增多,千粒重降低。一般年份可减产10%-20%,在气候条件沾发病严重时达40%。Rxo1基因来源Rxo1基因是来自玉米的一个抗玉米细菌性条斑病的寄主抗性基因，将其转入水稻后转基因水稻中接种细菌性条斑病病原菌，在接种点处表现典型的HR表型，证实该基因为一重要的非寄主抗性基因。Rxo1基因定位Rxo1基因CDS序列全长（从起始密码子ATG到终止密码子TAG）为2718bp。与许多R基因一样，该基因编码的产物是NBS-LRR结构的抗病蛋白（GenBank登录号为AAX31149.1），其蛋白质序列为905aa。根据SMART数据库软件扫描该蛋白的domains、repeats、m
4、otifs，找到一个从4-18位点的lowcompositionalcomplexity：IAVLLVLKKIAIALA及一个位于118-147的coiledcoilregion（LVSLDEIASEIKKIKQELKQLSESRDRWTK）；此外还预测到了37个其余结构（如UME_PTB、SynN、IRO、RING、NADH-G_4Fe-4、TOP1Ac、LRR_BAC、IFabd、SCAN、LytTR、LRR_CC、LRR_TYP及LRR_SD22等），但是其显著性未达到极显著的阈值。Sanger的分析则找到3个Pfam-Amatchs，其中显著的一个是NB-ARC结构：envelo
5、pe范围是183-470；比对结果的范围则是185-467；HMM范围为3-282；另有两个非显著的4个copy的LRR结构。基因Rxo1的双右边界双元载体的构建1.1菌株和载体含有9kbRxo1基因的pCAMBIA1305-1Rxo1质粒由美国堪萨斯州立大学ScotH.Hulbert博士提供。pCAMBIA1305-1质粒是由澳大利亚CAMBIA研究中心构建的含有35S启动子和细菌卡那霉素抗性基因的双元载体。采用的农杆菌菌株为EHA105。（1）美国Kansas州立大学的ScotH.Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-1质粒，其中携带有外源目的基因Rxol;pCAMBIA
6、1305-1质粒（2）澳大利亚CSIROPlantIndustry的MUpadhyaha博士提供双右边界双元载体pMNDRBBin6。该载体用于转接Rxol基因并将重组体转化到农杆菌中进行后续转基因:双右边界双元载体pMNDRBBin6结构图及可能产生的3种TDNA类型(3)农杆菌菌株为LBA4404;(4)大肠杆菌菌株为DHSa;1.2双右边界双元载体的构建1.感受态细胞的制备和转化2.双右边界双元载体构建（1）目的基因和载体的酶切连接将携带Rxol基因的载体pCAMBIA1305-1用限制性内切酶SacI(AGTVACT),NgoMN(GVCCGGC)进行消化，同时，用限制性内切酶X
7、maI(CVCCGGG)和HpaI(GTTVAAC)消化载体pMNDRBBin6。将酶切后得到的目的基因片断和双元载体用T4噬菌体连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌。质粒pCAMBIA1305-1-Rxol经内切酶SacI和NgoMIV酶切，得到大小为8.Skb的Rxol目的基因片断(图A)，载体pMNDRBBin6经HpaI和XmaI酶切，得到大小为12.3kb的线性化双右边界载体(图B)A:SacI和NgoMN酶切pCAMBIA
