电泳和电色谱ppt课件.ppt

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1、9电泳和电色谱电泳：在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的电极移动，这种现象称电泳（electrophoresis）电泳原理：1.最主要的特性是蛋白质的带电行为，产生电荷效应2.分子筛效应3.分子形状一、影响迁移率的因素1.电场强度：电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。电压在500V以上，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。聚丙烯酰胺凝胶电泳和SD

2、S电泳需要200～600V电压。2.溶液pH（分子电荷）3.离子强度电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成一个与运动质点符合相反的离子氛（ionicatmosphere），离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。4.电渗在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此

3、常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流>ν电泳时,阴离

4、子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。高效毛细管电泳流程图毛细管电泳的特点由于毛细管具有良好的散热效能，允许在窄内径毛细管两端加上高达30kV的高电压，分离毛细管的纵向电场强度可达400V/cm以上，可以在很短的时间内达到很高的分离效率，具有以下特点：（1）分离速度快（高压、高电场强度）在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子（2）分离效率高（N>105~106）（3）运行成本低（4）样品与试剂消耗量少

5、（1~50nL）（5）可供选择的分离模式多，应用范围广（6）分离一般在水溶液介质中进行（7）方法简单，仪器自动化程度高（8）环境污染小表1高效毛细管电泳与高效液相色谱性能比较二、电泳的分类按分离的原理分：区带电泳等速电泳等电聚焦按有无支持物分：自由电泳（无支持物）支持物电泳支持物电泳技术（1）.纸电泳（2）.醋酸纤维薄膜电泳（3）.粉末电泳:如淀粉，纤维素粉，玻璃粉（4）.凝胶电泳①淀粉胶②聚丙烯酰胺凝胶（普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸）③琼脂（糖）凝胶（孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及

6、其亚型，大分子核酸等应用较广）。（5）.缘线电泳:如尼龙丝,人造丝电泳区带电泳在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。等速电泳示意图等速电泳等速电泳是在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分离离子的大）和终末离子（其迁移率比所有被分离离子的小），样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的

7、区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载带电流，所得到的区带是相互连接的，且因“自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。等电聚焦示意图等电聚焦等电聚焦电泳是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交

8、联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。聚丙烯酰胺凝胶的形成三、电泳的应用蛋白质的的分离、纯化与鉴定核酸分析及DNA排序（AnalysisofNucleicAcidsandSequenceofDNA）图CGE模式分