电泳和电色谱ppt课件.ppt

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1、9电泳和电色谱Electrophoresisandelectrophoreticchromatograph1电泳概念ArneTiselius——物理化学家、诺贝尔奖金获得者定义——荷电的胶体粒子在电场中的移动；电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。2电泳概念电泳与色谱原理结合可以派生多种复合分离方法，如电泳色谱和电色谱。电泳色谱：将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合电色谱：利用电渗作用驱动流动相流动，分离作用主要源于溶质在色谱固

2、定相和流动相间的分配平衡特性多数情况下二者无严格区分，均称为电色谱39.1基础理论电泳的简单原理蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。4albumin白蛋白Globulin球蛋白Serum血清59.1.1电泳速度9.1.1.1自由溶液中的电泳速度Stoke’sLaw（斯托克斯定律）6Stoke’sLaw（斯托克斯定律）如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来

3、自于颗粒上的有效电荷Z和电位梯度E，它们与介质的摩擦阻力f’相抗衡，这种抗衡服从斯托克斯定律：f=EZef’=6πvrηv是介质粘度为η中半径为r的颗粒的移动速度。但实际情况中，f’还取决于凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至是介质的内渗等。79.1.1电泳速度当电场力和黏性阻力达到平衡时，即f=f′时，荷电溶质恒速泳动U0为电解质溶质的迁移率，是单位电场强度下的泳动速度（淌度）8双电层厚度带电粒子迁移率9电泳迁移率电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。其单位是cm2·sec-1·V-1电泳迁移率的不同提供了从混合物

4、中分离不同物质的基础109.1.1.2凝胶中的电泳速度聚丙烯酰胺凝胶的浓度Tg单位质量分数Cg交联剂质量分数a丙烯酰胺单体质量b交联剂单体质量m缓冲液质量Tg与u有关11凝胶电泳迁移率up365Ferguson线图当Cg一定时，凝胶电泳迁移率lgu与Tg呈线性关系。12电泳的大致分类依据电泳原理，现有三种形式的电泳分离系统移动界面电泳（movingboundaryelectrophoresis）区带电泳（zoneelectrophoresis）稳态电泳（steadystateelectrophoresis）其中区带电泳是目前常用的电泳系统。13区带电泳

5、表示在一个电场的作用下，在某一种支持介质上（或均一的缓冲液中），能将混合物分离成若干区带的电泳过程。移界电泳（界面电泳）：对物质只起到部分分离的作用，混合物以同一界面移动，只有最前面的成分有部分提纯的，其它则相互重叠。14等速电泳：在电泳达到平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。它的区带没有重叠。等电聚焦：利用各种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度，使被分离物各自移动到其等电点处而聚成很窄的区带。15区带电泳的主要技术区带电泳中的常用技术载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳16凝胶

6、电泳的支持介质：聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PAG）由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成；琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1,3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D吡喃半乳糖交替形成的；9.2凝胶电泳17丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的，通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素（引发剂）来引发该过程；以N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。丙烯酰胺的化

7、学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下，产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由基状态，经过一系列的自由基反应得到的聚合物；18影响聚合的主要因素引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40~60分钟内完成。系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果；19影响聚合的主要因素温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性；分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合；20聚丙烯酰胺凝胶电泳中的

8、分子筛效应在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，