DNA重组技术的基本工具 讲课ppt课件.ppt

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1、基因工程一、基因工程的概念：基因工程：又叫基因拼接技术或DNA重组技术。基因工程：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。理论基础：生殖方式：基因重组无性繁殖或克隆概念分析：剪切拼接导入表达基因拼接技术或DNA重组生物体外基因DNA分子水平人类所需要的基因产物3、基因的运输工具（分子运输车）。到哪里去寻找这种酶——限制性核酸内切酶（限制酶）——DNA连接酶——运载体1、基因的剪刀（分子手术刀）；2、基因的针线（分子

2、缝合针）；二、基因工程的基本工具：主要从原核生物中分离纯化而来已经分离出大约4000种1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列2、使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。形成两种末端：黏性末端、平末端1、分子手术刀——限制性核酸内切酶黏性末端黏性末端被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。限制性内切酶手术过程：什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。要想获得某个特定性状的基因片段必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个

3、切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。平末端　　　平末端当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。限制酶切割DNA两条单链形成的切口都一样吗？1’2’3’4’5’脱氧核苷酸的结构G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯键3’端5’端3’端5’端磷酸二酯键一种限制酶只识别一种特定的双链DNA分子的核苷酸序列，切割特定切点。限制性内切酶作用特点是什么？从双链DNA分子每一条链中特定部位

4、的两个核苷酸之间切割，切断磷酸二酯键。①、专一性：②、内切性：13仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？限制酶的识别序列不同：限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、

5、使之失效，从而达到保护自身的目的。寻根问底?为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRI限制酶的作用把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来，催化形成磷酸二酯键。2、分子缝合针——DNA连接酶：两DNA片段要具有互补

6、的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合黏性末端过程：可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低。DNA连接酶的缝合平末端过程：连接两种末端使用的DNA连接酶一样吗？19类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)注意：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA

7、连接酶与DNA聚合酶的比较:只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用返回有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制并带着插入的目的基因一起复制质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。3、分子运输车—基因进入受体细胞