DNA重组技术的基本工具课件.ppt

《DNA重组技术的基本工具课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、专题一：生物1的基因（目的基因）生物2获得新性状导入第一至三步骤三个工具第四步骤限制酶DNA连接酶运载体一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1名称来源：限制性核酸内切酶，又称限制酶主要从原核生物中分离纯化。2作用特点：识别特定核苷酸序列，使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。1.种类与命名现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）SmaⅠ大肠杆菌（EscherichiacoliR）EcoRⅠ练习：流感嗜血杆菌的d菌

2、株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ命名方法作用特点——断开磷酸二酯键磷酸二酯键T12345A12345HHHHHOT12345A12345HHHHOH2O+7仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列作用特点——断开磷酸二酯键EcoRⅠ黏性末端黏性末端

3、作用特点——断开磷酸二酯键SmaⅠ平末端　　　平末端AATTGCCTTAAG限制酶DNA解旋酶区别限制性内切酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键打开形成两条单链限制酶DNA水解酶区别限制性内切酶与DNA水解酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一

4、种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。二、“分子缝合针”——DNA连接酶1种类：⑴E·coliD

5、NA连接酶⑵T4DNA连接酶2作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。3作用原理：催化磷酸二酯键形成连接酶类型类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝

6、隙“缝合”起来，但效率较低DNA连接酶的缝合作用DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用返回限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性

7、内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。（1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）小试身手基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定限制酶限制酶DNA连

8、接酶无切割位点一个切割位点二个切割位点EcoRⅠ切割的目的基因EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ载体的条件⑴有1~多个限制酶切点目的是形成重组DNA分子用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒EcoRⅠ切割质粒一个切割位点目的基因一个切割位点载体的条件⑴有1~多个限制酶切点载体的条件⑵对受体细胞无害⑶能在受体细胞中复制和表达载体的条件⑷具有标记基因1载体需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对