FISH技术及其临床应用ppt课件.ppt

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1、荧光原位杂交技术及其在医学中的应用FISHmethodsanditsmedicalapplication1一、荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH)60年代PardueGall建立（一）方法与原理：制备DNA探针（用生物素或荧光素标记）（下图）→变性﹢制备CS或间期细胞标本→变性处理→探针与待测DNA杂交→洗脱→用荧光素标记的生物素亲和蛋白使杂交区发荧光（信号放大）(下图）→荧光显微镜检测2（二）探针制备方法1.缺口平移法(Nicktranslatrion)用生物素（biotin)标记dUTPDNA酶Ⅰ切口DNA

2、polymeraseⅠ5`→3`外切酶活性DNApolymeraseⅠ5`→3`聚合酶活性BdUTP35`3`3`5`↓DNAseⅠ5`3`3`5`OHp↓﹢DNA聚合酶Ⅰ﹢标记核苷酸GGC↓OHOHOHOHpBBGCUAUA5`3`3`5`5`3`3`5`4分子杂交与信号放大BBB荧光素亲和蛋白抗体探针待测基因CCGAGGCTGGCUCCGA(略）2.随机引物法（randomprimer):6聚核苷酸klenow酶56FISHProcedureDenaturethechromosomesDenaturetheprobeHybridizationFluoresc

3、encestainingExamineslidesorstoreinthedark7（三）探针种类1）探针池探针（cs涂抹探针）：可结合在整条CS上每一部位。24色（常CS22条＋XY）8Wholechromosomeprobes9Wholechromosomeprobes10112）着丝粒探针：结合于着丝粒处，检测间期核内DNA数（CS数）1213Repetitivesequenceprobes143）端粒探针：结合于端粒处154)特异位置探针:cs某一具体位置探针例：Yq12repetitiveprobe1617位点特异性探针185）染色体臂涂抹探针：结合于

4、cs的q或p上。19（四）探针标记方法间接标记（前述）时间长信号明显直接标记时间短信号弱20二、FISH种类：以FISH过程中探针结合部位或探针颜色的不同，将FISH分为多种。211.CentromereSingleColorFISH222.SingleColorFISH(Telomeres)233.DualcolorFISH244多色荧光原位杂交255.SpectralKaryotyping(SKY)（光谱核型分析）266.24colorsFISH277.M-FISHwithtelomeresandcentromeres28M-FISHwithchromoso

5、mebandingspecificprobes298.间期FISH30三、FISH优点（Advantage）:lesslabor-intensivemethodforconfirmingthepresenceofaDNAsegmentwithinanentiregenomethanotherconventionalmethods31FISH-aprocesswhichvividlypaintschromosomesorportionsofchromosomeswithfluorescentmoleculesidentifythepresenceandlocati

6、onofaregionofDNAwithinmorphologicallypreservedchromosomepreparations,thencanidentifieschromosomalabnormalitiesoftenusedduringMphasebutisnowusedoninterphaseaswell32四、FISH在医学中的应用举例1、用已知探针检测未知CS畸变332、用显微切割方法检测未知CS畸变显微切割→PCR→CS特异探针池(黄色荧光)→与正常人CS杂交(例:2号染色体某段发黄色荧光)结果？343、产前诊断例:检测间期细胞内DNA分子

7、数例：21三体例：18三体354、植入前诊断PreimplantationGeneticDiagnosis(PGD)36图示1例13/14罗式易位携带者的胚胎植入前FISH诊断资料：一对6年不育，女，32岁，cs正常，男34岁，核型：45，XY,t(13;14)(q10;q10),并伴少、弱精。采用单精子卵泡浆（intracytoplasmicsperminjection,ICSI)辅助授精，胚胎发育到3天6-8细胞期取出一个细胞进行双色FISH检测。参图：用13q和14q探针，见核中2个13号（绿色）和2个14号（红色）信号细胞，表明？37移植后18周做羊水细

8、胞CS检查38PGD39