实验室操作手册.doc

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1、1微生物鉴定1.1显微镜相关操作1.1.1简单染色实验步骤：涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴蒸馏水，用接种环取菌涂在载玻片上，做成菌悬液。晾干：让载玻片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用火缓慢烘干。固定：拿住载玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。染色：将固定过的载玻片加复红染色1～2min。水洗：用蒸馏水洗去载玻片上的染色液。干燥：将载玻片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。镜检：先用低倍镜观察，再切换到高倍镜观察，并在找到视野后，将高倍镜转出，在载玻片上加入一滴香柏油，将油镜浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。1.

2、1.2革兰氏染色实验步骤：涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴蒸馏水，用接种环取菌涂在载玻片上，做成菌悬液。晾干：让载玻片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用火缓慢烘干。固定：拿住载玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。结晶紫染色：在载玻片上加适量（盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min。水洗：用蒸馏水洗去结晶紫染液。媒染：滴加碘液，媒染1min。水洗：用蒸馏水洗去碘液。脱色：将载玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。复染：滴加番红复染5min。水洗：用蒸馏水洗去番红染液。晾干：将染色

3、好的载玻片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。镜检：先用低倍镜观察，再切换到高倍镜观察，并在找到视野后，将高倍镜转出，在载玻片上加入一滴香柏油，将油镜浸入油滴中仔细调焦观察细菌的革兰氏染色反应性。1.1.3扫描电镜样品制备取材：选取培养良好的微生物菌液约5～7mL。分装到1mL离心管中，12000rpm离心5min，弃置上清液，收集菌体。清洗：用PBS缓冲液（pH=7.2）清洗菌体，12000rpm离心5min，弃置上清液，收集菌体，重复5～7次，确保菌液中没有残留培养基。固定：常用固定剂有2.5%戊二醛，1%四氧化锇。在4℃下固定一晚上。次

4、日用PBS缓冲液（pH=7.2）清洗样品。脱水：用40%、70%、90%和100%的乙醇分别依次脱水，每次15min。经脱水后的样品应马上干燥，若无法进行干燥操作，应当将脱水后的样品放置在－80℃冰箱中保存。干燥：菌体样品一般采用真空冷冻干燥法、临界点干燥法对菌体进行干燥处理。镀膜：将菌体样品放在真空镀膜机内，把金喷镀到样品表面后。镀膜完成后取出样品制备完毕。1.1.4透射电镜样品制备超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术,广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技

5、术叫做超薄切片技术。样品制备步骤：取材：选取培养良好的微生物菌液约5～7mL。分装到1mL离心管中，12000rpm离心5min，弃置上清液，收集菌体。清洗：用PBS缓冲液（pH=7.2）清洗菌体，12000rpm离心5min，弃置上清液，收集菌体，重复5～7次，确保菌液中没有残留培养基。前固定：将菌体样品浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液，离心沉淀后送到电镜平台（农业微生物学国家重点实验室C座1楼），由平台工作人员负责抽真空和块状处理。注意：泡在2.5％戊二醛固定液的菌体材料最多可以放2周。漂洗：用PBS缓冲液（pH=7.2）冲洗3次

6、，每次15mins。后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。真菌、细菌一般处理2h。注意事项：a，锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。b，锇酸比较昂贵，需特别节约使用。漂洗：用PBS缓冲液（pH=7.2）冲洗3次，每次15mins。脱水：室温下，依次用30％，50％，70％，80％，90％丙酮作用30mins，再用100%纯丙酮脱水3次，每次30mins。渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入细胞内。植物样品需要的渗透梯度多、渗透时间长。其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以水稻叶片为例，其渗透流程如下：a,无水丙酮/包埋剂＝5

7、：1作用12h;b,无水丙酮/包埋剂＝3：1作用12h;c,无水丙酮/包埋剂＝1：1作用12h;d,无水丙酮/包埋剂＝1：3作用12h;e,无水丙酮/包埋剂＝1：5作用12h;f,纯包埋剂45℃作用12h。注意事项：包埋剂为强致癌剂，特别要注意规范操作！包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45℃聚合12h，60℃聚合36～48h。超薄切片：在超薄切片机上进行超薄切片，切片面积最大不能超过0.5mm×0.3mm。正染色：超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟；去二氧化碳的双蒸水清洗3次；醋酸铀染色30分钟；双蒸水清洗3次；等超薄切片干燥后，即

8、可上透射电镜观察。注意事项：a，醋酸铀具有放射性，使用时要特别注意。b，柠檬酸铅染液极易和空气中的二氧化碳反应形成不溶解的黑色颗粒，污染切片。柠檬酸铅染液一定要现用现配，所用的双蒸水一定要煮沸除去二氧化碳。