基因细胞治疗策略利用成熟干细胞的天然能力修复受损组织ppt课件.ppt

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1、基因/细胞治疗策略：利用成熟干细胞的天然能力修复受损组织DarwinJ.Prockop,M.D.,Ph.D.,Director,CenterforGeneTherapy,TulaneUniversityHealthSciencesCenter,NewOrleans,LA翻译者：violet39(DXY)Cohnheim(1867)年提出：可能是通过来自于血液中的细胞进行自身修复的。最近的一些假设认为：可能最先是从许多组织中发现的干细胞样细胞开始的。然后这些细胞可能被骨髓中的干细胞耗尽。机体是如何进行自身修复的？我们并不在进化

2、树的最高处：水蛭、涡虫等可以从很少的细胞复原完整的器官；蜥蜴和类似的动物可以恢复断肢或断掉的尾巴；大鼠和小鼠的大部分器官都不易发生永久性的伤害。修复系统是如何较好的工作的？利用骨髓中的干细胞样细胞使人类具有和啮齿类动物或者蜥蜴一样的修复能力；我们的方法是扩增患者自身细胞；基因/细胞治疗策略局部麻醉，抽取骨髓运用基因工程手段大量扩增骨髓间质细胞治疗同一个患者骨骼及相关疾病中枢神经系统疾病问题1、骨髓中确实含有非造血器官干细胞吗？2、如果有，是什么细胞呢？3、如果有，这些细胞是如何修复组织的呢？问题1、骨髓中确实含有非造血器官干

3、细胞吗？已从下列实验得出一些结论性数据a、观察细胞培养时的分化性；b、动物实验；c、骨髓移植和器官移植的患者。（参见Prockopetal.PNAS100(1):11917-23,2003）2、骨髓中有哪些细胞？造血干细胞（CD34*或CD133*）？“侧群”细胞？多功能成熟祖细胞？骨髓间充质干细胞(MSCs)？或是一些仍未确认的细胞？骨髓中的一个候补的修补细胞分离：——将骨髓放置在塑料表面中；该种细胞有许多名字：——“骨髓间质细胞”，由于它常被用作HSCs的供给层——“间质干细胞”，由于它能分化成多种细胞类型两者折衷，这种

4、细胞被称做：“MSCs”Friedenstein，1976，指出粘附细胞(MSCs)具有下述特点：——有核细胞所占比例为：1:10,000到100,000；——能快速增殖；——在体内或体外可分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞；容易克隆，得到的克隆可分化——没有融合+/-肌管+/-神经前体细胞单细胞克隆软骨细胞成骨细胞脂肪细胞呼吁将MSCs用于治疗1、相对容易：——分离和扩增，——由同一个患者获得；2、具有多向分化的潜能；3、不会形成肿瘤；4、倾向于定向于损伤组织和修复组织。MSCs的扩增由2ml骨髓开始扩增——可得到5亿个以上

5、的MSCs；——需要2周的时间；扩增密度效应培养12天后，细胞量变到原来的2000倍。(Colter,DiGirolamo,Prockop,2000)几种细胞1、纺锤形细胞；2、大而扁平的细胞；3、很小，圆形，“迅速自我恢复”细胞（RS细胞）。细胞在低密度和高密度时的分裂倍数。扩增密度效应但是为什么：——有延滞期?——培养之前的稳定期是同步的?推测：——需要合成和分泌生长刺激物。合成和分泌的量图1MSC培养物用35S标记的甲硫氨酸，柱状图分别表示35S标记蛋白在细胞(C)和培养基中的量(M)。当细胞生长进入平台期时，蛋白合成

6、减少。11111111111cm2细胞密度放射自显影观察培养基状态放射自显影银染纯化、浓缩的35kDa提取物新合成并被35S标记的细胞分泌蛋白有纤维结合蛋白(F)、层粘连蛋白(L)和一个未知蛋白(*)。这个未知蛋白从含有大量胎牛蛋白的培养基中纯化出来。胰蛋白酶酶解16小时，SELDITOF=Dickkopf-1,Wnt信号转导通路的抑制剂从这个35kDa的蛋白中酶解得到的七个肽段与从一个先前鉴定的Wnt信号转导通路抑制剂中酶解的七个肽段具有相同的分子量。重组Dkk-1缩短MSCs培养过程中的延滞期（重复实验）每个微量测试孔

7、中的细胞数量每个微量测试孔中的细胞数量处理时间处理时间Dkk-1抗体——延长延滞期细胞数量天Wnt抑制剂，Dkk-1在快速扩增的hMSCs细胞中表达Dkk-1：Wnt信号传导通路的抑制剂接触抑制，粘附，连接MSCs培养过程中特殊的增殖动力学a、细胞在低密度培养时维持在延滞期，直到大量合成Wnt信号传导通路抑制剂Dkk-1。b、当Dkk-1的合成停止，细胞表达Wnt促进信号转导通路的配体Wnt-5α时，细胞进入稳定期；c、当把细胞再次传代，这个过程会重复进行，直到传4-6代，细胞进入衰亡阶段为止。稀释细胞密度(4-6Xs)细胞

8、/集落Dickkopf-1(Dkk-1)Wnt信号传导通路抑制因子；在大多数系统中抑制Wnt信号传导，使细胞增殖停止；一个可能性：用于MSCs培养另一个可能性：Dkk-1可用于扩增病人自身MSC细胞的疾病治疗中。随培养状态变化的MSCs系统RS前体细胞——扩增缓慢——长端粒RS细胞——快速