微生物浸入试验.doc

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1、类别：技术标准冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证编码：部门：生产技术部页码：共4页，第1页1.目的：1.1.通过微生物侵入试验确认冻干生产线中压塞、扎盖密封系统是否完好。2.编制依据：2.1.《药品生产质量管理规范》2010年版2.2.《中国药典》2010年版二部3.支持性文件：标题文件编号存放地点4.概述：4.1.微生物侵入试验是对容器/密封系统完好性的挑战性试验。在验证试验中，取西林瓶，装入培养基，在正常生产线上压塞、扎盖。此后，将容器密封面侵入高浓度运动菌液中，取出、培养并检查是否有微生物侵入，以确认容器密封系统完好性。此同时，需作阳性对

2、照试验，确认培养基的促菌生长能力。5.范围：本确认方案适用于本公司冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证。6.实验材料大豆胰蛋白胨肉汤培养基（SCDM/2）、铜绿假单胞菌(ATCC9027)、革兰染色、含0.5％的过乙酸的70％异丙醇、冻干粉针生产线西林瓶、胶塞、铝盖、冻干粉针生产线压塞机及轧盖机、盛菌悬液的容器、固定西林瓶支架等。7.时间安排年月日———年月日类别：技术标准冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证编码：部门：生产技术部页码：共4页，第2页8.试验步骤8.1.试验用培养基的制备。8.1.1.在生产线上取足够量按相应清洁灭菌规程制备好的

3、西林瓶、灌装已灭菌的SCDM/2(大豆胰蛋白胨肉汤)培养基，在冻干生产线上抽真空、压塞及扎盖将西林瓶密封。8.1.2.将密封良好的西林瓶取出，每一西林瓶倒转，使培养基与容器内表面充分接触，并小心去除至少50个试样的铝盖，注意不要破坏其密封口（将去铝盖时不慎损坏容器密封性的所有试样剔除），在30~35℃下竖放培养14天。8.1.3.接受标准：在培养期内，各试样不生长菌。8.2.确认培养基促菌生长能力----营养性试验8.2.1.所有试样培养14天均不长菌时，随机取出20个带盖试样，每个试样内接种0.1ml的铜绿假单胞菌ATCC9027，菌液浓度：10

4、~100CFU/0.1ML8.2.2.在30~35℃下培养7天，或培养至所有试样都呈阳性结果。8.2.3.若7天内，所有接种铜绿假单胞菌的试样中，微生物生长良好，则容器内培养基的促菌生长能力合格。8.2.4.可是使用革兰染色和紫外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质，来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌。8.3.挑战菌悬浮液的制备8.3.1.从铜绿假单胞菌ATCC9027的新鲜斜面上取一整环培养物，分别接入含6ml无菌培养基的试管中，在30~35℃下培养16~18小时。8.3.2.将每管的培养物分别转入含600ml相同培养基（SCDM/2）的容

5、器内，于30~35℃下培养22~24小时。在培养结束时，能明显见容器内培养基出现浑浊。8.3.3.在挑战试验开始时，挑战用菌悬液浓度（活菌数）必须达到：1*106CFU/ml。8.3.4培养结束后的菌悬液即可用来作压塞、扎盖密封系统系统完好性试验。8.4.微生物侵入试验本试验需在生物安全柜内或其他不影响生产环境的地方进行。类别：技术标准冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证编码：部门：生产技术部页码：共4页，第3页8.4.1.将新鲜的铜绿假单胞菌ATCC9027菌悬液倒入合适的盆中，用金属支架固定试样容器，使试样倒置在菌悬液中。8.4.2.将50个

6、经过冻干线的抽真空、压塞、扎盖的西林瓶的试样倒置入菌悬液中，该组试样记为A组。同时，将25个去除铝盖的试样容器倒置入菌悬液中，该组试样记为B组。（试样容器内的无菌培养基应充分接触封口内表面，样品的颈部及封口的外表面应完全浸泡在悬液中）。8.4.3.实验开始时取一份菌悬液，平板计数每毫升所含的活菌数，并通过革兰染色方法确认微生物是铜绿假单胞菌。8.4.4.将A组及B组试样容器在菌悬液中持续浸泡约4小时。8.4.5.浸泡结束时，利用平板计数法计数菌悬液的浓度。从菌悬液中取出试样，擦干试样容器外的残余菌悬液，然后用含0.5％的过乙酸的70％异丙醇消毒容器

7、外表面。8.4.6.取装满培养基的有铝盖和去铝盖的样品各两个，作为阳性对照。阳性对照试样不经过菌悬液的浸泡，其外表用含0.5％的过乙酸的70％异丙醇消毒，后接入10~100CFU铜绿假单胞菌ATCC9027。8.4.7.将消毒后所有的试样放在塑料袋中，在30~35℃下培养7天。在操作过程中不要损坏无铝盖试样胶塞的密封性。8.4.8.培养7天后，对每一试样进行观察检查，有微生物生长记作“+”，无微生物生长记作“—”。将结果记录在《冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性试验结果记录》。类别：技术标准冻干生产线压塞、扎盖密封系统完好性验证编码：部门：生产技术

8、部页码：共4页，第4页8.4.9.如果容器中长菌，利用革兰氏染色法鉴定所长菌为铜绿假单胞菌；如果容器中不长菌，则从浸过菌悬