JX-01菌株保存传代及销毁作业指导书.docx

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1、1.目的建立检定用菌种的管理制度，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。2适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、传代、使用及销毁等。3定义标准菌种是指由中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心

2、获得的冷冻干燥菌种为第0代。4职责4.1技术主管负责菌种的申购、保存、分发。4.2微生物检验员负责菌种的鉴定、传代、使用及销毁。5程序或要求5.1标准菌株的申购技术主管根据标准菌株的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），交由部门领导审批后，向中国工业微生物菌种保藏管理中心购买冻干菌种（标准菌种），购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。5.2标准菌株的接收菌种到达实验室后，由技术主管检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株一览表》上，内容包括：序号、标准菌株名称、标准号、级别、标识号、制造单位、有效期限，并将

3、其暂贮存于4～8℃冰箱中。5.3标准菌株的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。5.3.2传代用菌种的保存在无菌条件下，打开冻存管的螺旋瓶盖，用接种环挑取18~24h新鲜细菌或霉菌纯培养物，放入冻存液中，拧紧瓶盖，来回颠倒使菌体乳化，配成3~4麦氏比浊度的菌悬液。此时菌悬液会吸附在小瓷

4、珠内外表面，用无菌移液器将冻存管中的菌悬液尽量吸出，吸出的菌悬液应放入消毒液中并随后进行高压灭菌处理，拧紧瓶盖，-70℃冰箱中保存。填写《标准储存菌株传代记录》和《菌株保存记录》。5.4标准菌株的传代标准菌株菌种的传代因是冻干菌（标准菌种）与传代用菌种而不完全相同。5.4.1标准菌种的复苏、确认、传代5.4.1.1标准菌种的复苏5.4.1.1.1把冻干菌种管、微量移液器及吸头（1ml）、烧杯、镊子、无菌水、营养肉汤培养基数支，移入微生物室的超净工作台或生物安全柜。5.4.1.1.2将冻干菌种管外壁用75%乙醇棉擦净，待干。点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在

5、火焰上，烧灼红热，用灭菌吸头吸取无菌水，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。5.4.1.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌烧杯内，另取1支灭菌吸头，在火焰旁吸取营养肉汤培养基0.5mL，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，转移至4~5mL营养肉汤培养基并用一次性无菌吸管吸取几滴,将其滴到营养琼脂斜面内，根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24～72小时（细菌需要24～48小时的培养物，酵母菌需要72小时的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子，放线菌和丝状真菌则应培养7～10天）。最后将所用过的物品及菌种管经高

6、压灭菌（121℃，20min），并填写《菌株复苏、划线记录》和《废液（物）处理记录》。5.4.1.1.4取出培养物，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活生长，若不浑浊，在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前，细菌应至少培养1周以上，霉菌和酵母菌至少应培养2周以上，并在丢弃之前应高压灭活处理（121℃，20min）。5.4.1.2标准菌种的确认5.4.1.2.1用无菌接种环取上述培养物划线接种到TSA培养基（细菌）或孟加拉红培养基（霉菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存

7、和鉴定。然后在36℃下培养2天（细菌）；28℃下培养3天（霉菌和酵母菌）。培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。5.4.1.2.2菌种的确认结果，记录在《菌株鉴定记录》上。5.4.1.3标准菌种的传代5.4.1.3.1按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的营养肉汤培养基内，称第1代（G1），复

8、壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单