第5章 荧光光谱ppt课件.ppt

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1、第5章荧光光谱5.1基本原理5.2荧光探测5.3荧光光谱法的应用5.1基本原理荧光属于光致发光包括吸收和发射两个过程荧光光谱属于发射光谱光致发光可以在紫外-可见光区、X射线区等我们将关注紫外-可见光区，常用于有机化合物分析5.1.1荧光发光原理光致发光的能级向下跃迁过程无辐射跃迁：激发态→第一电子激发态的最低能级在激发态因碰撞以热的形式损失能量，跃迁到第一电子激发态的最低能级荧光发射：第一电子激发态的最低能级→基态能级由第一电子激发态的最低能级跃迁至基态，光的形式释放能量，即荧光磷光发射：三重态→基态能级先无辐射跃迁至三重态，逗留较长时间后再跃迁至基态能级，发射磷光荧光与磷光的区别从

2、激发态跃迁到基态的路径不同从激发到发光的时间不同，荧光10-9~10-7s磷光10-3~10s(三重态是亚稳态)发光波长不同，荧光波长比磷光波长短5.1.2荧光光谱与吸收光谱形状波长谱带数荧光光谱与吸收光谱的比较荧光光谱灵敏度高，检测限可达ppb量级（10-9）荧光光谱选择性好，能吸收光的物质不一定能发射荧光，一定波长下不同物质的荧光光谱不同荧光光谱没有吸收光谱使用广泛，许多物质不产生荧光，并且荧光对环境因素非常敏感5.1.3产生荧光的基本条件入射光要能被物质粒子吸收，使粒子能够跃迁到激发态，然后经第一电子激发态的最低能级，降落到基态振动能级物质粒子要具有高的荧光效率荧光过程速率常数

3、，由物质粒子本身决定物质分子结构与荧光效率具有大共轭双键的分子容易发射荧光，π→π*跃迁的量子效率高，寿命短（10-9~10-7s）共轭效应越大，荧光效率越高，苯<萘<蒽苯萘蒽物质分子结构与荧光效率（Cont.）刚性平面分子荧光效率更高，会减小分子振动，从而减小与其它分子碰撞的可能，芴≈1.0>联苯0.18芴联苯取代基也会影响荧光效率给电子基(-NH2,OH)会增强荧光效率（共轭作用）吸电子基(-NO2,-C=O,-C=NH)会减弱甚至猝灭荧光取代基的空间阻碍作用会减弱荧光5.1.4影响荧光光谱的因素（外部）入射光强，荧光强度与入射光强成正比溶剂，一般溶剂效应，折射率和介电常数的影响

4、特殊溶剂效应，物质分子与溶剂的化学作用增大溶剂极性，向长波移动，荧光强度增加温度，升高温度→物质粒子碰撞增多→减弱荧光pH值，荧光物质本身弱碱或弱酸性时影响较大内滤光，溶液中存在能吸收荧光的物质，减弱荧光自吸收，溶液浓度较大时，部分荧光会被物质本身吸收吸收光谱与荧光强度（激发的选择？）波长强度吸收光谱波长强度荧光光谱吸收强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下跃迁产生的荧光越强5.2荧光探测5.2.1荧光探测装置吸收光谱荧光光谱两点区别：在入射光的垂直方向探测探测器前还有一个单色器F-4500荧光光度计光路图（日立）5.2.2荧光团许多物质不会发射荧光或荧光效率低需要利用强荧光发

5、射的荧光团（或荧光探针分子）荧光探针分子需满足两个条件：(1)能与待测物质某个微区专一而牢固的结合(2)这种结合不会破坏物质分子的结构和空间构象一些典型的荧光团色氨酸348nm4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚461nm增强型绿色荧光蛋白509nm四甲基罗丹明576nm染料667nm染料cy3的吸收、发射光谱最大激发波长550nm最大发射波长570nm(黄绿光)绿色荧光蛋白（GFP）GFP荧光是生物细胞的自主功能，GFP是一种广泛应用的活体报告蛋白5.2.3荧光探测方法同步荧光光谱技术(1)在同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下测量荧光光强，由测得的荧光强度对发射或激发波长作图(2

6、)两种同步扫描形式——固定波长和固定能量(3)固定波长：激发波长与发射波长间隔固定(4)固定能量：激发光波光子能量与发射光波光子能量差固定(5)特点：①与激发光谱及发射光谱都有关系，能使选择性进一步改善②能够增强强带而减小弱带的干扰③它可以消除瑞利散射信号的干扰，也能够使拉曼强度降低，但同时会把拉曼吸收峰拉宽(6)波长间隔的选择非常重要！利用同步荧光光谱分离色氨酸1、酪氨酸2和苯丙氨酸3的重叠荧光峰一般荧光光谱同步荧光光谱(波长差70nm)时间分辨荧光光谱技术(1)时间分辨荧光技术用于测量荧光发光过程（很短的衰减过程）(2)用短脉冲信号激发荧光，取样积分探测随时间变化的荧光强度(3)

7、时间分辨荧光技术可以对发射光谱重叠但寿命有差异的组分进行测定，也可以测量荧光衰减曲线及寿命相位分辨荧光光谱技术(1)也可以用于测量荧光寿命(2)基本原理：用正弦（或余弦）方式调制激发光光强，这样发射光强也会被正弦（或余弦）调制，由于吸收和发射之间的时间延迟，所以发射光的调制信号相比于激发光存在相位延迟，测量该相位延迟就可以得到荧光寿命(3)相分辨荧光技术是一种稳态测量技术，相比于时间分辨荧光技术，其灵敏度更高。5.3荧光光谱法的应用5.3.1元素分析（无机