光谱分析荧光光谱课件.ppt

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1、光谱分析--分子荧光光谱Molecularfluorescencespectroscopy主讲人:杜一平荧光光谱分析概况荧光分析仪器和应用目录基本原理激光扫描共焦荧光显微镜荧光探针光致发光:荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。这种再发射的光称为荧光。特点：★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个数量级；★线性范围宽；★选择性比吸收光谱法好。发射荧光或磷光的物质种类有限；★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。分子荧光光谱法：基于化合物的荧光测量的分析方法概况荧光光谱种类：原子荧光、分子荧光、X射线

2、荧光光谱。分子荧光应用：地质、冶金、化工、环保、医药、生物、化学等。荧光光谱新技术：同步荧光光谱三维荧光光谱时间分辨荧光光谱荧光相关光谱激光诱导荧光光谱荧光标记物、荧光探针荧光成像单分子检测概况基本原理分子的激发与去激发分子的多重态单重态一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。三重态有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。激发过程:激发态分子不稳定，它要以辐射或无辐射跃迁的方式回到基态。基本原理无辐射跃迁☆

3、振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。☆内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。☆系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。☆外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。基本原理辐射跃迁:荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8~10-11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大。磷光：从第一激发三重态

4、的最低振动能级回到基态所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4~10s。基本原理1.荧光强度与浓度的关系F=K′（I0—I）I0——入射光辐射强度；I——透射光辐射强度；K′——荧光量子产率（Ф）。荧光强度及影响荧光的因素荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与荧光物质的吸光程度及其发射荧光的能力有关。基本原理F=K′（I0—I）根据朗伯-比尔定律，=εbc则假设εbc＜0.05F=K’I02.303εbc当I0一定时F=K·C(K=K’I02.303εb)即在低浓度时，溶液的荧光强度与

5、荧光物质的浓度成正比，这是荧光法定量的基础。基本原理荧光量子产率Φ物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因素都可使荧光增强。Φ与失活过程的速率常数k有关：基本原理荧光与结构的关系（1）电子跃迁类型发射π*→π跃迁比π*→n跃迁更常见（2）共轭效应芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多数未取代芳烃在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度增加，荧光峰红移，Φ↑。简单杂环化合物不发荧光，但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。（3）平面刚性结构效应有刚性结构的分子

6、容易发荧光，刚性和共平面性的增加有利于荧光发射。CH2联苯Φ=0.2芴Φ=1基本原理化合物相对荧光强度苯10C6H5COOHC6H5NO230C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020C6H5ClC6H5BrC6H5I750(4)取代基的影响芳环上有羧基、羰基或亚硝基等吸电子基团取代时，荧光减弱；给电子取代基如-OH、-NH2、-CN、-OCH3等会使荧光强度增加。重原子效应含有重原子的分子中，系间窜跃的几率大,使荧光减弱，磷光增强。基本原理荧光与环境因素的关系★温度降低会使荧光强度增大；★带有酸性

7、或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关；★溶剂溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变；含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。★溶解氧的存在往往使荧光强度降低。化合物相对荧光强度C6H5OH18C6H5O—10C6H5NH220+C6H5NH30基本原理激发光谱和荧光光谱任何荧光化合物都具有两种特征光谱：荧光激发光谱（吸收光谱）固定某一发射波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱。荧光发射光谱（荧光光谱）固定某一激发波长，测定荧光发射强

8、度随发射波长变化得到的光谱。两者关系：大体上镜像基本原理荧光分析仪器和荧光法的应用荧光分光光度计荧光分光光度计既可用于定量分析，也可用于测绘激发光谱和