第11章 植物细胞工程技术原理

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1、第11章植物组织培养（PlantTissueCulture)主要内容组织培养的理论基础组织培养技术操作影响组织培养效果的因素第一节组织培养技术操作组织培养技术流程？组织培养1选择植物材料2培养基5培养(温度控制等）4接种3灭菌一、培养基及其配制培养基的组成成分培养基的分类培养基的配制1、培养基的组成成分最早风眼兰栅栏组织Knop溶液+蔗糖存活不分裂1934年White番茄根离体培养成功（1937年发现B族维生素的作用，创立White培养基）1948年Skoog和崔真烟草茎段培养发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用培养基的组成：水、无机盐

2、、糖、有机物、植物激素、其他添加物等。1、培养基的组成成分糖：碳源，维持培养基的渗透压3%（2~6%）无机盐：一般有10~20种，分为大量元素和微量元素两类。大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo一种离子一般由一种以上的无机盐提供，以保证离子平衡，避免由于培养物吸收差异引起的pH变动。1、培养基的组成成分有机物：维生素类VitB1（硫胺素）VitB6（盐酸吡哆醇）VitB3（烟酸）VitB5（泛酸钙）肌醇氨基酸CH（水解酪蛋白）、LH（水解乳蛋白）ME（麦芽提取物）、YE（酵母浸出物）1、培养基的组成成分植物激

3、素：生长素类：诱导细胞的分裂和根的分化；IBA、IAA、NAA、2,4-D0.1mol/L的NaOH配制细胞分裂素类：促进细胞分裂和分化不定芽6-BA、KT、ZA、2iP0.5或1mol/L的HCl配制1、培养基的组成成分其他添加成分：固化剂（gellingagent）：琼脂用量一般为7-10g/L，即0.7-1%（W/V）太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固。吸附剂：活性碳，适用于培养中容易形成不利于生长的分泌物的培养物。pH变动高中化学：无机盐溶液酸碱性的判断依据是，该盐是否发生水解。强酸强碱盐如NaCl中性；强酸弱碱盐如NH4Cl酸性；强碱弱

4、酸盐如Na2CO3碱性。大学：植物对矿质元素的吸收是以离子形式进行的，以交换吸附方式发生，阳离子和H+发生交换吸附；阴离子和HCO3-13种必需矿质元素的吸收量存在如下关系：大量元素：N＞K＞Ca＞Mg=P＞S；微量元素：Cl=Fe＞Mn＞B＞Zn＞Cu=Mo(NH4)2SO4中，吸收量N＞S，培养基中H+多，生理酸性盐，pH减小KNO3中，N＞K，HCO3-多，生理碱性盐，pH增大。2、培养基的分类按性质分：基本培养基完全培养基：基本培养基加激素按状态分固体培养基液体培养基2、培养基的分类基本培养基按照组成成分又可分为很多种，常见的如MS、Mi

5、ller、B5、N6、T、LS、H、KM8P等。根据其盐浓度大致可分为四类：富盐平衡培养基：MS高硝态氮培养基：B5、N6中盐培养基：Miller，大量元素浓度为MS的一半低盐培养基：White，生根培养3、培养基的选择查阅文献资料，参考已有研究结果选择基本培养基确定激素种类和浓度（配方）自己实验4、培养基的配制（1）、母液配制：母液：实际是一种贮存液，比实际使用溶液浓度高。方便，准确。以KNO3为例：1L培养基需要量为19g，在配制母液时，增加为10倍量即190g，这样用母液配制培养基时，只要1/10的母液量就可以了。4、培养基的配制（1）、母液配

6、制：一般把母液分成大量元素、微量元素、有机物等几类进行配制。大量元素配制成10-20×的母液微量元素配制成100-200×的母液有机一般配制成100×的母液激素单独配制成1mg/ml的母液4、培养基的配制2、培养基的配制称取适量的糖（固体培养基还需要琼脂），溶解根据要配制的培养基体积按比例加入所需体积的母液（如有琼脂则需煮沸至澄清）加入激素，定容（热不稳定激素需灭菌后加入）调节pH值为5.8~6.0（这一步一定要最后操作）二、灭菌灭菌、消毒、防腐物理方法：热力灭菌干热160度2h玻璃和金属器皿湿热高压蒸汽灭菌都适用电离辐射：各种射线一次性器械和物品如

7、注射器紫外灭菌：紫外线照射20~30min空气和物体表面消毒二、灭菌化学方法：重金属盐如0.1%HgCl2氧化剂如高锰酸钾、10%NaClO表面活性剂：酒精、洁尔灭甲醛等二、灭菌过滤除菌：适用于不能通过高温高压灭菌的物质，应用各种细菌过滤器灭菌。针头式滤器、正压式金属滤器二、灭菌接种室和培养室：定期熏蒸灭菌熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾三、外植体的选取及接种培养1、外植体（explant）的选取外植体：是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源：一是生长在自然环境下的植物；二是

8、有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物；三是无菌环境下已经过离体培养的植物。二、外植体的选取及接种培养1