第六章同核核磁实验方法.doc

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1、granmr14.doc第六章同核核磁实验方法通常所谓同核核磁谱指的是1H同核谱，因为一般有机物富含氢，而1H的天然丰度达99.98%，而且1H的旋磁比最大，因而核磁信号最强。其他核的核磁信号的检测相对来讲都比较困难，尤其是蛋白质中有意义的如13C，15N的天然丰度分别只有1.11%和0.36%,相对1H的检测灵敏度只有0.0159和0.00104，因此要检测蛋白质中的13C及15N一定要有同位素标记才行，而且还需长时间累加。一般同核谱可研究的蛋白质分子量的上限在1万左右，当然还要求蛋白质在溶液中有足够的溶解度，化学位移的分布比较分散。蛋白质中质子的化学位移基本上是rand

2、omcoil的化学位移加上不同构象的影响。如b折叠多的蛋白质同a螺旋多的蛋白质相比，化学位移更为分散，谱峰也更容易解析；同种氨基酸残基多的蛋白质，即使分子量较小，由于化学位移可能会比较密集，谱峰解析可能比稍大一些的蛋白质还要困难。已经发表的脉冲序列有上百，但通常可以看作常规实验的为数不多。6.1一维氢谱在记录二维谱或三维谱等之前均需要记录一维氢谱，通常蛋白质溶于水或适当的缓冲液，加5-10%的D2O作为锁场介质。一维氢谱可用于检查样品是否有足够浓度，通常16－32次采样要能得到足够信噪比的谱图，甲基由于快速旋转呈现窄峰，而酰胺质子由于化学交换及14N的标量弛豫呈现宽峰；一维

3、氢谱还可用于检查样品的共振峰宽是否合理，蛋白质在高浓度下容易聚集从而增宽谱线，严重时甚至1H谱上看不到明显的峰，样品在这种条件下显然无法进行核磁研究；一维氢谱还可用于判别样品的化学位移分布情况，可判别样品是否变性，同时也对研究工作的难度提供一些预测。10granmr14.doc上图显示ubiquitin（一种蛋白质，76个残基）的一维谱：a水溶液中，b箭头所指甲基区的放大，c8M尿素溶液中，显示变性谱。蛋白质的一维氢谱一般不应该有非常尖的峰，若出现这种峰，往往是残留的小分子杂质，当然蛋白质的末端及loop区由于分子运动较快也会出现一些较尖的峰。当样品条件不佳时，一维谱（以及

4、若干信号强的二维谱）可用来探索适合的样品条件。6.2COSY型实验6.2.1COSYACOSY(correlatedspectroscopy),是人们发明的第一种二维谱，同时也是研究蛋白质的最有用的二维谱之一。二个有J偶合的核在COSY上可产生一个交叉峰，由于蛋白质（包括多数其他有机物）中有J偶合意味着这两个核最多通过3个共价键连接，所以COSY谱对于分子结构的拓扑连接可提供非常有价值的信息。10granmr14.doc左图是COSY的脉冲序列，只由2个90度脉冲组成，两脉冲之间是演化期，理想脉冲本身不产生其他杂信号，故不需相循环抑制：因此基本的相循环为：f1=x;f2=x

5、;fref=x实际上由于演化期的弛豫以及第一个90度脉冲的不准确会产生轴峰，需要用2步循环抑制：第一个脉冲及接收机相位同时反转通常还加上CYCLOPS循环以抑制硬件不平衡产生的其他杂信号这样形成8步循环：f1=02132031f2=00112233fref=02132031二维谱有幅度谱和相敏谱之分，由于相敏谱的分辨率高，通常要尽量用相敏谱。B以下是可以在Bruker核磁谱仪上用于记录蛋白质COSY谱的脉冲程序，脉冲序列在Bruker谱仪上称作微程序:;cosyprst.WJH#include“p2=p1*2”“d0=in0/2-p1*4/3.14

6、159”“d11=30m”“d12=20u”“d13=3u”“l3=(td1/2)”1ze2d113d114d12pl9:f1d1cw:f1d13do:f1d12pl1:f1p1ph1d0p1ph2go=2ph31d11wr#0if#0ip1zdloto3times2d11id0loto4timesl3exitph1=02201331ph2=0022113310granmr14.docph31=02201331C脉冲序列分析a二自旋体系考虑相循环的第一步第一项为纵向磁化，第二项为多量子项，均不能被观测到；第三项仍然是第一核的横向磁化，在检测期的频率同演化期类似，均是第一核的

7、，对应于对角峰；第四项是第二核的反向磁化，在检测期的频率为第二核的化学位移，与演化期不同，对应于交叉峰，这是二维谱最有意义的峰。进一步将后两项的系数分解：可见，对角峰在F1维位于W1，同相裂分成两个成分，距离2pJ12；而交叉峰在F1维也位于W1，但反相裂分成两个成分，距离也是2pJ12。由于一个信号为正弦调制，另一个为余弦调制，对角峰信号与交叉峰信号在相位上相差90度，故在F1维两者不能同时调相成吸收型信号。再看F2维，对角峰为同向磁化，在检测期呈现同相裂分，距离2pJ12；交叉峰在F2维为反向磁化，在检测期呈现