DB44∕T 1411-2014 J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程.pdf

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1、ICS07.080B41备案号：44781-2015DB44广东省地方标准DB44/T1411—2014J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程TheLAMPdetectionofsubgroupJavianleukosisvirus2014-08-18发布2014-11-18实施广东省质量技术监督局发布DB44/T1411—2014前言本标准按GB/T1.1-2009的规则进行编写。本标准的附录A为资料性附录。本标准由广东省农业厅提出并归口。本标准起草单位：华南农业大学兽医学院。本标准主要起草人：曹

2、伟胜、罗开健、樊惠英、徐成刚、廖明。本标准首次发布。ⅠDB44/T1411—2014J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程1范围本标准规定了Ｊ亚群禽白血病病毒（ALV-J）的环介导等温扩增试验（LAMP）检测规程，适用于J亚群禽白血病病毒的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。GB/T26436-2010禽白血病诊断技术。3术语和定义GB/T26436-20

3、10确定的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是指一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA910聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60℃～65℃恒温扩增，经15min～60min即可实现10～10倍的靶核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。3.2特异性引物（primer）是指针对特定模板DNA基因片段设计的一小段与DNA

4、片段互补的人工合成寡核苷酸。4J亚群禽白血病病毒的LAMP检测以下所有试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1仪器、材料及试剂4.1.1仪器设备：PCR仪、凝胶电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像管理系统、高速台式离心机(离心速度12000r/min以上)、台式离心机或手掌式离心机(离心速度3000r/min)、移液器(0.1µL～2µL，1µL～10µL，10µL～100µL，100µL～1000µL)、水浴箱、旋涡振荡器。4.1.2材料：0.5mL和1.5mL

5、离心管。4.1.3pH7.40.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）：称取磷酸氢二钠1.096g、磷酸二氢钠0.316g和氯化钠8.5g，溶解于950mL蒸馏水中，完全溶解后用氢氧化钠或盐酸调pH至7.4，定容至1000mL，灭菌后使用。4.1.4组织裂解液：10mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）；1mmol/LEDTA；0.5%SDS。4.1.5蛋白酶K（10mg/mL）：将蛋白酶K1g溶解于灭菌水50mL中，轻轻摇动，直至完全溶解，加灭菌1DB44/T1411—2014水定容至100

6、mL。4.1.6RNaseA（10mg/ml）取RNaseA0.5g置于50ml塑料离心管中。加入灭菌水40mL，溶解之后定容至50mL，100℃煮沸15min，缓慢冷却至室温，分装后置于-20℃保存。4.1.775%乙醇溶液：取无水乙醇750mL，加入灭菌水定容至1000mL，-20℃保存。4.1.8溴化乙锭(10mg/mL)：取溴化乙锭1.0g，加入水90mL，完全溶解后定容至100mL，用铝箔包裹容器或移至棕色瓶中，室温保存。4.1.950×Tris-冰乙酸电泳缓冲液（TAE）：在500m

7、L水依次加入Tris242g、冰乙酸(无水乙酸)57.1mL、pH8.0的0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）100mL，加水定容至1000mL。4.1.101×TAE缓冲液工作液：50×TAE缓冲液20mL，加水定容至1000mL。4.1.111％琼脂糖凝胶将洁净的制胶板水平放置在工作台上，放上合适的梳子。准确称量琼脂糖1.0g，于三角瓶中，加入100mL1×TAE电泳缓冲液，加热溶解琼脂糖，待琼脂糖溶液冷却至约50℃时，加入10mg/mL溴化乙锭溶液5μL，充分混合。将琼脂糖凝胶溶液沿胶

8、板边沿缓慢连续注入，凝胶厚度控制在4mm～5mm左右，待凝胶完全凝固后，将凝胶板放置入已加入1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使液面没过凝胶，拔出梳子，以备加样电泳。4.1.12电泳凝胶加样缓冲液：蔗糖40.0g、pH8.0的0.5mol/LEDTA20mL、10%十二烷基磺酸钠（SDS）5mL、溴酚蓝50.0mg、水75mL。先将蔗糖完全溶解于水，然后按顺序加入其余各成分，完全溶解后混匀，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。4.2样品的采集制备及DNA的提取4.2.1样品的采集无菌操