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《DB44∕T 1411-2014 J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、ICS07.080B41备案号:44781-2015DB44广东省地方标准DB44/T1411—2014J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程TheLAMPdetectionofsubgroupJavianleukosisvirus2014-08-18发布2014-11-18实施广东省质量技术监督局发布DB44/T1411—2014前言本标准按GB/T1.1-2009的规则进行编写。本标准的附录A为资料性附录。本标准由广东省农业厅提出并归口。本标准起草单位:华南农业大学兽医学院。本标准主要起草人:曹
2、伟胜、罗开健、樊惠英、徐成刚、廖明。本标准首次发布。ⅠDB44/T1411—2014J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程1范围本标准规定了J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的环介导等温扩增试验(LAMP)检测规程,适用于J亚群禽白血病病毒的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件。GB/T26436-2010禽白血病诊断技术。3术语和定义GB/T26436-20
3、10确定的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是指一种新型的核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,在链置换DNA910聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下,60℃~65℃恒温扩增,经15min~60min即可实现10~10倍的靶核酸扩增,具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。3.2特异性引物(primer)是指针对特定模板DNA基因片段设计的一小段与DNA
4、片段互补的人工合成寡核苷酸。4J亚群禽白血病病毒的LAMP检测以下所有试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1仪器、材料及试剂4.1.1仪器设备:PCR仪、凝胶电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像管理系统、高速台式离心机(离心速度12000r/min以上)、台式离心机或手掌式离心机(离心速度3000r/min)、移液器(0.1µL~2µL,1µL~10µL,10µL~100µL,100µL~1000µL)、水浴箱、旋涡振荡器。4.1.2材料:0.5mL和1.5mL
5、离心管。4.1.3pH7.40.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS):称取磷酸氢二钠1.096g、磷酸二氢钠0.316g和氯化钠8.5g,溶解于950mL蒸馏水中,完全溶解后用氢氧化钠或盐酸调pH至7.4,定容至1000mL,灭菌后使用。4.1.4组织裂解液:10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris);1mmol/LEDTA;0.5%SDS。4.1.5蛋白酶K(10mg/mL):将蛋白酶K1g溶解于灭菌水50mL中,轻轻摇动,直至完全溶解,加灭菌1DB44/T1411—2014水定容至100
6、mL。4.1.6RNaseA(10mg/ml)取RNaseA0.5g置于50ml塑料离心管中。加入灭菌水40mL,溶解之后定容至50mL,100℃煮沸15min,缓慢冷却至室温,分装后置于-20℃保存。4.1.775%乙醇溶液:取无水乙醇750mL,加入灭菌水定容至1000mL,-20℃保存。4.1.8溴化乙锭(10mg/mL):取溴化乙锭1.0g,加入水90mL,完全溶解后定容至100mL,用铝箔包裹容器或移至棕色瓶中,室温保存。4.1.950×Tris-冰乙酸电泳缓冲液(TAE):在500m
7、L水依次加入Tris242g、冰乙酸(无水乙酸)57.1mL、pH8.0的0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)100mL,加水定容至1000mL。4.1.101×TAE缓冲液工作液:50×TAE缓冲液20mL,加水定容至1000mL。4.1.111%琼脂糖凝胶将洁净的制胶板水平放置在工作台上,放上合适的梳子。准确称量琼脂糖1.0g,于三角瓶中,加入100mL1×TAE电泳缓冲液,加热溶解琼脂糖,待琼脂糖溶液冷却至约50℃时,加入10mg/mL溴化乙锭溶液5μL,充分混合。将琼脂糖凝胶溶液沿胶
8、板边沿缓慢连续注入,凝胶厚度控制在4mm~5mm左右,待凝胶完全凝固后,将凝胶板放置入已加入1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中,使液面没过凝胶,拔出梳子,以备加样电泳。4.1.12电泳凝胶加样缓冲液:蔗糖40.0g、pH8.0的0.5mol/LEDTA20mL、10%十二烷基磺酸钠(SDS)5mL、溴酚蓝50.0mg、水75mL。先将蔗糖完全溶解于水,然后按顺序加入其余各成分,完全溶解后混匀,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,4℃保存备用。4.2样品的采集制备及DNA的提取4.2.1样品的采集无菌操
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