2019年 定量PCR原理及PCR仪光学原理ppt课件.ppt

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1、定量PCR技术原理陈云地8008100192，021-64736366-407chenydappliedbiosystems1基本概念定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理等位基因鉴定原理定量PCR仪光学原理内容提要2reverseprimerforwardprimer3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'什么是PCR链式反应的雪崩效应3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3平台期典型的PCR分4个

2、阶段线性增长期基线期指数增长期4N=N0x(1+E)nN:扩增子数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环数PCR理论方程5PCR方程只在指数期成立Log[DNA]循环数线性增长期平台期y=x(1+e)n指数增长期6同一个样品重复96次起点定量与终点定量终点定量起点定量起始DNA量是样本中本来的量，更有意义；终点DNA量经过PCR“加工”，不是研究所需要的数据起点定量误差小，终点定量误差大7标准曲线方法标准品未知样本8定量PCR的数学原理什么是CT值荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数CT值半对数图谱CT值线

3、性图谱10CT值与起始DNA浓度的关系CT值lg起始DNA浓度CT=-klgX0+b为什么CT起始DNA浓度?总信号=本底信号+分子数量单位信号强度Rn第n个循环时的总信号RB本底RS单位信号强度X0起始DNA数目EPCR效率Rn=RB+X0(1+E)nRs12为什么CT起始DNA浓度?当循环次数n=CT值时：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即CT=-klgX0+b（线性方程）Rn=RB+X0(1+E)nRs13什么是阈值基线范围阈值标准偏差

4、基线信号的标准偏差x1014CT值基线阈值基线调整规则如果CT值>18，不需调整，使用自动分析结果如果CT值<18，修改终点，再分析一次起点：进口试剂取3，国产试剂取6终点：最小的CT值–4，通常为15长度：大于或等于6个循环基线阈值CT值15PCR方程只在指数期成立Log[DNA]循环数线性增长期平台期y=x(1+e)n指数增长期CT值和阈值必须位于指数增长阶段内16实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给出结果和图谱如果CT值>18，使用自动分析结果，出报告如果有CT值<18，根据[最小的CT值-4]修改基线终点，重新分析数据手工数据分析方法1

5、7软件自动的数据分析方法软件自动计算全部参数：基线、阈值、CT值、浓度18定量PCR的化学原理两种定量化学染料染色SYBR®GreenI溴乙锭(EthidiumBromide)探针标记TaqManTMTaqManMGBDual-oligoFRETpairs分子信标(Molecularbeacons)ScorpionsTM/AmplifluorTM20TaqMan探针的结构3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'21TaqMan探针定量原理reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.聚合probeRQ3'3'5'5'3'5'

6、5'2.链取代Q3'3'5'5'3'5'5'3.探针被切断R3'5'5'3'5'5'4.聚合完成QRR=报告基团ReporterQ=淬灭基团Quencher3'22TaqMan探针的共振能量转移当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。Försterresonanceenergytransferthroughspace(FörsterAnn.Phys.1948)荧光共振能量转移(

7、FRET)24Taq酶的5’→3’外切活性25TaqManMGB探针的好处FAMMGB完全配对，有信号FAMMGB一个碱基不配对，没有信号MGB探针能够分辨1个碱基的差别26TaqManMGB探针原理AGGCCTTGAGAGATATRGCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR

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23、QQ(non-fluorescentquencher)NFQQMGB(minorgroovebinder)NFQMGBR报告荧光无荧光淬灭基团小沟结合物提高探针Tm值27提高Tm值15mer提高18°