第九讲PCR技术ppt课件.ppt

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1、聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）PCR技术：概念：通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。广泛用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。PCR技术产生的历史背景1971年，Khorana等人就提出了利用PCR在体外扩增DNA的概念；Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因；1988年，Chien从水生栖热菌（Thermusaquaticus

2、）中分离出耐热DNA聚合酶，简称TaqDNA聚合酶；Mullis正式确定了体外扩增DNA技术，1987年获得专利，命名为PolymeraseChainReaction(PCR)。PCR反应的基本过程PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①变性(denaturation)将模板DNA置于92～96℃处理，使dsDNA链解开成为ssDNA，以便它与引物结合.PCR反应的基本过程②退火(annealing)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合成局部双链；PCR反应的基本过程③延伸DNA模板--引物

3、结合物在TaqDNA聚合酶的催化作用下，以dNTP为反应原料，按碱基配对与半保留复制原理，引物沿5’→3’方向延伸，最终合成一条新的与模板DNA链互补的DNA链。PCR反应的基本要素模板DNATaq酶dNTP引物Mg2+TemplateDNA模板DNA的数量与纯度，是PCR成败与否的关键环节之一。但不同类型PCR反应对模板DNA数量与纯度的要求不同。数量：3×106个拷贝酵母菌10ng细菌1ng质粒1pg纯度:RAPDOD260/OD280=1.6～1.9AFLPOD260/OD280=1.7～1.8DNAPolymeraseTaqDNAPolymera

4、se来源：古细菌嗜热水生菌(thermusaquaticus)特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于90%，在95℃下反应2h后为40%；②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶；③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0kb)；④具有5’→3’外切酶活性，但无3’→5’外切酶活性，因而对某些单核苷酸错配无校正功能。pfuDNAPolymerase来源：是从Pyrococcusfuriosis中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶。特点：①它不具有5’→3’外切酶活性，但具有3’→5’外切酶活性，因而可纠正PCR过

5、程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低；②PCR产物为平端，无3’端突出的单A核苷酸，不能进行T-A克隆。VentDNAPolymerase来源：从嗜热高温球菌(ThermococcusLitoralis)中分离出的。特点：①不具有5’→3’外切酶活性，但具有3’→5’外切酶活性，可以去除3’错配的碱基，具有校对功能；②PCR产物为平端，无3’端突出的单A核苷酸，不能进行T-A克隆；③PCR产物的扩增长度可达10kb以上。Primers（引物）引物：在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链DNA片段。primers随机引物：

6、引物为随机设计的短序列，通常为10bp左右，扩增产物的非特异性高，易受扩增条件影响；特异引物：引物根据特定的DNA序列设计而成，扩增产物的特异性强；简并引物：是根据密码子的简并性原则，以蛋白质序列中的氨基酸保守区反向设计而成的，扩增产物的特异性比较强。InsuF5'-AATCAGCACCTATGTGGTTCTCAYYTNGTNGA-3’InsuR5'-GCTGGTACAGAGAGCAGATGGAAKYRCARCAYTG-3'其中Y=C/TN=A/T/C/GK=G/TR=A/G简并引物PCR引物设计的基本原则合理的设计可在扩增的特异性和有效性之间找到一个平

7、衡点。1引物长度通常18～30bp；2解链温度(Tm);Tm=4(G+C)+2(A+T)3GC含量以40%～60%为宜，GC太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带；PCR引物设计的基本原则4ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；5避免引物内部出现二级结构，以及避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；6引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；7引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分

8、析或分子克隆很有好处；8引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源