《定量PCR技术》PPT课件

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1、定量PCR技术李文亭简单介绍什么是PCRPCR的工作原理PCR的基本反应步骤PCR的用处解链温度定量PCR理论部分相对RT-PCR定量RT-PCR定量PCR竞争性RT-PCR实时定量PCR定量PCR实验部分实验准备：实验器具与材料实验器具的处理与准备试剂的配制定量PCR实验部分实验操作设计PCR反应引物细胞的培养与收集总RNA的提取RNA完整性检测--Northern印迹技术RNA纯度检测合成cDNA的引物的选择反转录为cDNAPCR反应TheEnd设计PCR反应引物三条基本原则引物设计软件引物浓度要求总RN

2、A的提取异硫氰酸胍/氯化铯超速离心法制备RNA使用Trizol纯化RNA热酚法氯化锂-尿素法利用Marligen总RNA快速纯化系统纯化总RNA利用Ambion的Mitropoly(a)Pure试剂盒分离mRNARNA完整性检测Northern印迹原理Northern印迹技术是分析RNA的一种方法，该技术可定量分析某一特异基因转录的强度，根据其迁移的位置也可判断基因转录产物的大小。该技术常用于基因表达的调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。Northern印迹步骤琼脂凝胶电泳、转移、预杂交、杂交、漂洗、放

3、射自显影RNA纯度检测待测核酸以水为溶剂并作适当稀释（这里稀释400倍：5μlRNA样品+1995μl蒸馏水），使用1cm光程的石英比色杯，以水调好仪器的零点，然后测定并记录样品液在280，260nm处的吸光度。以估算RNA的纯度和浓度。OD260/OD280在1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染可以容忍。合成cDNA的引物的选择1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。。2）Oligo(d

4、T)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。3）特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物。PCR反应相对RT-PCR的PCR扩增竞争性RT-PCR的PCR扩增实时定量PCR扩增操作相对RT-PCR的PCR扩增相对RT-PCR的实验过程有三个关键步骤：1）选择一种定量方法：溴化乙锭染色，或者放射自显影-闪烁计数仪，或者用磷光摄像仪定量。2）相对RT-PCR要确定其扩增的线性范围：复制的PCR产物每隔

5、一个循环从热循环仪中取出并收集，通过用产物的量（取对数）对循环数作图，其线性范围是一条直线。下一页3）相对RT-PCR的内对照一般用看家基因，这样可使对样品进行处理和变换细胞类型时，内对照的表达不受影响。其次要求内对照的表达水平要与目的转录本的表达水平相似，这可以在扩增体系中添加竞争子来削弱看家基因的信号。竞争子是一些经过修饰无法延伸的引物。通过实验确定引物：竞争子的比例来模拟目的转录本的量，一旦这一比例被确定，他就可以和线性范围的循环参数一起对RNA样品中的转录本的量进行定量。下一页样品和内对照同时进行单链

6、cDNA合成反应，之后加入到反应管中同时进行PCR的扩增，然后用变形凝胶来分析实验结果。定量样品PCR产物的相对含量，可以用基因特异性产物的信号除以内对照的信号，从而可以得到每个样品中基因特异产物的准确相对值。这些值可以用来比较样品间模板RNA的相对表达量。返回竞争性RT-PCR的PCR扩增竞争性RT-PCR的关键步骤是人工竞争子的合成和纯化。竞争子与目的的内源转录本几乎一样，只是为了辨别在设计时删除了一小部分。竞争子是设计用于反转录和PCR扩增的RNA分子，与目的内源转录本具有相同的效率。接下来是竞争子RN

7、A的合成、纯化和定量。之后是对样品进行拷贝数的评估。要先进行预实验。即模板与梯度稀释（102）的竞争性RNA转录本同时进行PCR扩增反应。由于设计时竞争子具有与目的基因同样的反应动力学，可以与目的基因共同扩增，而且在每个反应中样品和竞争子PCR产物的量可以直接比较。竞争子获得的PCR产物的强度与来自于内源RNA转录本的扩增相抑制，同等强度代表RNA样品中存在的内源信息。下一页之后，将选择出的拷贝数2倍梯度稀释重复上述过程，以便在数据上得到更高的分辨率。为了对影响竞争子和外源转录本的反转录效率的变量进行控制，要

8、做一个最终的RT-PCR实验，在这个实验中样品RNA和竞争子RNA在同一个管中被反转录。使用竞争子RNA的量要接近于在初始RT-PCR实验中所提出的量，之后进行反转录、扩增。如前所述，与内源信息产生同样信号强度的竞争子RNA的量代表了样品中内源信息的量。返回实时定量PCR扩增操作A：流程：1标准曲线2待测cDNA的PCR扩增B：软件使用1打开电脑2开启5700，9600的电源3打开SDS软件，4选择