徐州工程学院教案纸.doc

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1、徐州工程学院教案纸实验五、甲醛滴定法徐州工程学院教案纸六、实验结果V1=V2=V3=m=徐州工程学院教案纸实验六、动物肝脏中DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳检测Ⅰ：动物肝脏中DNA的提取徐州工程学院教案纸Ⅱ、琼脂糖凝胶电泳检测实验目的本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA含量与分子量。实验原理根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下显色。琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。1）在电场的作用下及中性pH的缓冲条件

2、下，带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。2）在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。3）溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于

3、DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。一、材料肝脏DNA，1.5ml塑料离心管二、设备微量移液器(20μl)，高压灭菌锅，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，微波炉，紫外透射仪等。三、试剂准备1.TAE电泳缓冲液：50X储存液，pH8.5：242gTris碱，57.1ml冰醋酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，加水至1L；1X工作液：40mmol/LTriAc，2mmol/LEDTA2．溴化乙锭（EB）：10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套）3.DNAloadingbuffer（上样缓冲

4、液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。(作用：增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的迁移率约与300bp的线状双链DNA相同，而二甲苯氰FF约与4000bp的DNA相同。)4DNAMaker标准分子量：λDNA/EcoRI+HindIIIMaker5.1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml1×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，缓缓倒入架有

5、梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TAE），即可上样。6.无菌水四实验操作1、琼脂糖凝胶的制备1）取50×TAE缓冲液20ml，加水至1000ml，配制成1×TAE稀释缓冲液，待用。2）胶液的制备：称取1g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入100ml1×TAE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀,此为1％琼脂糖凝胶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3）胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用透明胶带(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支

6、持物上,插上样品梳子。4）向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入5μl溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为轻轻摇匀，0.5μg/ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。检查有无气泡。室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，注意不要损伤梳底部的凝胶；清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。5)加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。2、琼脂糖凝胶电泳1）加样：取18μl检测样品与2μl(1/10体积)的10×DNA上样缓

7、冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。2）电泳：加完样后，插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。3）当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约1cm时，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。4）取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。在波长为302nm紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。3、实验结果及讨论1)动物基因组DNA在琼脂糖凝胶中应为一条带，2)有时出现几条带，可能时

8、DNA降解形成的。3)如提取过程中有机械损伤会造成DNA降解，可能在胶上出现弥散。[注意]EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容