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1、蛋白质含量测定方法的比较蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford）。其中Bradford法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。这4种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白
2、质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间。1凯氏定氮法1.1原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。1.2特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条
3、件为硫酸铜2.50g,硫酸钾0.10g,浓硫酸4.00mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验,消化时间仅为12min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置,可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便
4、、低耗、稳定的优点。2双缩脲法(Biuret)2.1原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出1个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。2.2特点双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响,采用0.5g样品,40mL双缩
5、脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一,方法简便，但灵敏度差，测定范围为1～20mg蛋白质。适用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。3紫外吸收法3.1原理蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质
6、溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。3.2特点最常用的紫外吸收法是280nm的光吸收法，含有核酸的蛋白质溶液使用280和260nm的吸收差法较好。蛋白质的稀溶液采用215与225nm的吸收差法。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。缺点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和
7、色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸在紫外区也有强吸收，但通过校正可以消除。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。4考马斯亮蓝法(Bradford)4.1原理Bradford法是根据蛋白
8、质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为595nm,蛋白质在1～1000μg范围内,蛋白质－色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。4.2特点考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速而稳定,2min左右即达到平衡,其结合物室温下1h内保持稳定，且在5～20min之间,颜色的稳定性
