冷冻电镜在生物医学中的应用ppt课件.ppt

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1、冷冻电镜在生物医学中的应用尹长城北京大学基础医学院生物物理学系北京大学蛋白质科学中心生物电子显微术的发展1950’sHall,Huxley&Brener(Oxford)发明了负染技术；研究了生物材料。-分辨率2nm.1960’sKlug(MRC-Cambridge)提出电子显微图像的三维重构理论；解析了T4噬菌体的结构。-1982诺贝尔化学奖。1970’sHenderson&Uniwin(MRC-Cambridge)建立了电子晶体学；解析了第一个膜蛋白bacteriorhodopsin的结构。-分辨率0.7nm.1980’sA

2、drian&Dubochet(EMBL)发明了快速冷冻技术-冷冻电子显微术诞生。-分辨率0.2nm.Whyhighresolution?18Proj./10deg.36Proj./5deg.72Proj./2.5deg.Whyhighresolution?传统样品包埋处理-负染法用重金属染料堆积在分子周围，反衬出分子结构优点：衬度大，易于观察缺点：染料颗粒较大，不能渗入分子内部外部形貌，缺乏细节样品脱水分子变形，结构失真分辨率低，2nm结构是低分辨的、失真的结构！现代样品包埋处理-冰冻法将样品快速的冷冻在玻璃态的冰中优点：样品

3、含水天然状态结构与在溶液中相同真实结构分辨率高，0.2nm结构是高分辨的、保真的结构！冰的物理状态冰可以多种物理状态存在六角形冰立方体冰玻璃态冰玻璃态冰是一种无定形状态保持生物分子的天然结构提供生物分子所需的水分冰的物理状态与水的冷冻速率有关在极高的冷冻速率（>104ºC/s)，水形成玻璃态的冰冷冻电子显微术（cryo-electronmicroscopy)主要步骤样品冷冻，将样品快速包埋在玻璃态冰中样品转移，将样品转移到液氮或液氦冷却的低温冷台中样品观测及图像采集，在液氮或液氦温度进行应用计算机进行图像处理和三维重构如何冷冻

4、包埋样品？－150℃Whycryo-electronmicroscopy?classicalnegativestainingcryo-electronmicroscopyAdrianM,DubochetJ,etal.Nature(1984),308:32-36.冷冻包埋的质量控制ABCDA:分布不均B:样品污染C:理想样品1.分布均匀2.没有重叠3.厚度均一D:厚度不均电子剂量对图像质量的影响10e/Å220e/Å230e/Å240e/Å210e/Å220e/Å230e/Å240e/Å2电镜观测和记录由于样品在辐射下产生损伤，

5、观测时须采用低剂量技术（lowdosetechnique)一般控制电子剂量≤20e/Å2低剂量技术寻找在低倍下进行（1-3k）聚焦在照像区域的相邻区域进行（100-300k)记录区域仅在照相时受到辐射（30-60k)Low-dosetechniqueFocusarea1FocusangleTiltaxisFocusarea2FocusdistanceSearchmodeexposuremode电镜与图像三维重构ElectronMicroscopyWhydoweneed3Dinformation?3Dobjectprojecti

6、on2DphotoDrawingbyJohnO’Brien,TheNewYorkerMagazine(1991)三维图像重构在电镜下观察样品时，所看到的是样品在垂直于电子束方向的投影（二维信息）要得到样品的三维结构，须将投影信息（二维信息）转变为三维信息将二维信息组合得到三维信息并得到三维结构的过程称为三维图像重构三维重构基本原理-中央截面定理三维函数投影的傅立叶变换(Fouriertransform)等于该三维函数傅立叶变换在垂直于投影方向的中央截面在电镜下，物体沿电子束方向投影的傅立叶变换是该物体三维傅立叶变换在垂直于电子

7、束方向的中央截面Theprincipleof3Dreconstruction三维物体二维投影二维投影的傅立叶变换三维傅立叶变换三维结构逆傅立叶变换KlugA,DeRosierDJ.Nature(1966),212:29-32.Theeffectofsampling18Proj./10deg.36Proj./5deg.72Proj./2.5deg.2-D晶体分子溶液单一结构电镜三维重构的方法生物电镜三维重构方法方法研究对象对象特点分辨率电子晶体学1.二维晶体周期排列0.19nm2.管状晶体0.40nm单颗粒技术1.病毒

8、全同粒子0.33nm2.大分子复合体0.40nm断层成像术1.细胞器/细胞单一结构4.0nm2.组织切片冷冻电镜在生物医学中的应用乙酰胆碱受体(AchR)通道已知：配体门控通道（乙酰胆碱）由5个亚基组成（）5个亚基围成一个孔（通道）每个亚基含4个-螺旋（M1-M4