冷冻电镜技术ppt课件.pptx

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1、冷冻电镜技术Cryo-EM学号201912708目录CONTENTS1冷冻电镜技术的概述什么是Cryo-EM、冷冻电镜的分类2冷冻电镜技术的发展1968—→Now3冷冻电镜技术的原理样品冷冻、冷冻成像、三维重构4冷冻电镜技术的应用结构生物学、医疗、具体应用场景PART1冷冻电镜技术的概述1冷冻电镜技术的概述冷冻电镜即冷冻电子显微镜(cryo-electronmicroscopy，cryo-EM)，是将生物大分子快速冷冻后，在低温环境下利用透射电子显微镜对样品进行成像，再经图像处理和重构计算获得样品的三维结构。什么

2、是Cryo-EM1冷冻电镜技术的概述看清楚分子级别的结构必须用电子显微镜1冷冻电镜技术的概述理论上电子剂量越高，成像质量越好然而生物分子太脆弱，无法承受法承受高剂量电子的冲击1冷冻电镜技术的概述用低剂量的电子束配合叠加平均的办法解析生物分子结构的方法成功拍照但要求分子在样品中整齐排列，这个方法普适性比较有限1冷冻电镜技术的概述通过给成千上万个随机朝向的同一种生物分子照相，得到不同角度的二维图像后再运用计算机软件进行三维重建，得到分子的完整三维结构1冷冻电镜技术的概述使生物分子能够快速冷冻在玻璃态的水中来减轻对分子

3、的破坏电镜底下观察可以得到高分辨率的照片冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）冷冻透射电镜技术是在普通透射电镜上加装样品冷冻装置，将样品冷却到液氮温度(77K),用于观测蛋白、生物切片等对温度敏感样品的一种技术。通过对样品的冷冻，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。冷冻扫描电子显微镜（Cryo-SEM）冷冻扫描电镜技术一般是在普通扫描电镜上加装低温冷冻传输系统和冷冻样品台装置，它是在扫描电镜的基础上发展起来的一种技术，可以直接观察液体、半液体的样品，不需要对样品进行干燥处理，最

4、大程度地减少了常规的干燥过程对高度含水样品的影响。冷冻蚀刻电子显微镜（Freeze-etching）冷冻蚀刻电镜技术是一种将断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，可以显示细胞、组织微细结构的立体构像。它具有使微细结构接近于活体状态、能够观察到不同劈裂面的微细结构、能使样品具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存等优点。冷冻电镜的分类1冷冻电镜技术的概述冷冻蚀刻电子显微镜原理是将样品置于干冰或液氮中进行冰冻，用冷刀劈开后，在真空中将温度回升到-100℃，使断裂面的冰升华，暴露出断面结构，最终得到可以观察的复膜

5、样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构冷冻蚀刻的样品，可以经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存1冷冻电镜技术的概述红细胞冷冻电镜蚀刻图PART2冷冻电镜技术的发展197419681975AaronKlug开创了基于负染的噬菌体病毒的电镜三维重构技术RobertGlaeser首次提出并进行了冷冻含水生物样品的电镜成像。RichardHenderson利用电子显微三维重构技术首次获得7埃

6、分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破冷冻电镜技术的发展21981JoachimFrank完成了单颗粒三维重构算法及软件Spider。1982JacquesDubochet开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作的不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品1990年RichardHenderson利用冷冻电镜技术获得了细菌视紫红质蛋白原子水平的三维结构模型，第一个用冷冻电镜解析出来的膜蛋白结构。2013冷冻电镜三维重构技术确定蛋白质TRPV1结构，标志着冷冻电镜跨入“原子分辨率”时代冷冻电镜技术的发展21975年，Ri

7、chardHenderson（理查德·亨德森）利用电子显微三维重构技术首次获得7埃分辨率的细菌视紫红质3D结构的历史性突破。这是人们首次观测到膜蛋白的跨膜螺旋三维结构。亨德森将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下进行观察，借助表面覆盖的葡萄糖防止真空干涸，并采用强度更低的电子束流，得出细菌视紫红质在细胞膜上是规整排列且朝向一致。之后，在前述AronKlug等人提出的三维重构技术的基础上，亨德森和同事获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像。亨德森所发展出来的方法也具有其局限性，这是因为他所研究的蛋

8、白本身的特性让研究者能够采用所谓“冷冻电子断层成像术”来测定其结构。简单来说，研究人员要转动细胞膜，从不同角度对蛋白拍照，最终构建出蛋白的三维结构。这种方法只适用于排列有一定规律的蛋白——如果它们是杂乱无章的，这种方法就难以奏效了。细菌视紫红质3D结构冷冻电镜技术的发展21981年，JoachimFrank（约阿希姆·弗兰克）完成了单颗粒三维重构算法及软件Spider，利