DB37T 4101-2020 苹果轮纹病菌快速检测方法.doc

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1、ICS 65.020.20B16     DB37山东省地方标准DB37/T4101—2020     苹果轮纹病菌快速检测方法Rapiddetectionofbotryosphaeriadothidea2020-08-31发布2020-10-01实施山东省市场监督管理局   发布DB37/T4101—2020前  言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省烟台市农业科学研究院。本标准主要起草人：王英姿、刘保友、汪少丽、王培松、石洁。4DB37/

2、T4101—2020苹果轮纹病菌快速检测方法1　范围本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限：10-7ng/μL苹果轮纹病菌DNA。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3　原理3.1　扩增原理根据苹果轮纹病菌的ITS序

3、列中特异性序列设计特异性内、外引物及环引物各一对，特异性序列参见附录A。三对引物特异性识别靶标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ITS基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。3.2　显色液显色原理SYBRGreenI是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，

4、随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。4　缩略语下列缩略语适用于本文件。LAMP：环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）ITS：内转录间隔区（Internaltranscribedspacer）2×LampMasterMix：等温扩增PCR混合液Bst酶：BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）5　试剂和材料4DB37/T4101—2020除有

5、特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为GB/T6682中规定的一级水。1.1　等温扩增PCR混合液（2×LampPCRMasterMix1)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。)）：包含40 mmol/LTris-HCl、20 mmol/L(NH4)2SO4、20 mmol/LKC1（pH值为8.8）、16 mmol/LMgSO4、2.0 mmol/LdNTPs、0.2 %TrionX-100。1.2　BstDNA聚合酶：酶浓度

6、8 U/μL。1.3　显色液：SYBRGreenI荧光染料，1 000×。1.4　引物：根据苹果轮纹病菌ITS基因序列设计一套特异性引物，包括外引物1（F3），外引物2（B3），内引物1（FIP），内引物2（BIP），环引物1（LF）和环引物2（LB）。外引物扩增片段长度：189 bp，引物序列见附录A。1.5　DNA快速提取液：DNA-EZReagentsAll-DNA-Fast-Out2)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。)。1.6

7、　甜菜碱：5 mol/L。1.7　离心管：0.1 mL、1.5 mL。1.8　塑料研磨棒：长度70 mm，研磨头外径6.2 mm，研磨头长度9.5 mm。2　仪器设备2.1　恒温箱：满足65 ℃±3 ℃、80 ℃±1 ℃要求。2.2　移液器：量程0.5 μL～10 μL，量程10 μL～100 μL，量程100 μL～1 000 μL。3　测定步骤3.1　试验设置3.1.1　阴性对照：采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌（Valsamali）基因组DNA为模板。3.1.2　阳性对照：采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌（Botryosphaeriadothi

8、dea）基因组DNA为模板，浓度应略高于方法检出限。3.1.3　空