DB37T 4052-2020 小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范.doc

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1、ICS 11.220B41     DB37山东省地方标准DB37/T4052—2020     小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范TechnicalspecificationforisothermalamplificationofPestedespetitsruminants2020-07-09发布2020-08-09实施山东省市场监督管理局   发布DB37/T4052—2020前  言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业

2、标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东师范大学、山东省农业科学院、中国动物卫生与流行病学中心、杭州众测生物科技有限公司、桂林市临桂区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：陈蕾、孙文博、吴晓东、陈艳如、廖炳次、蒋文明、李华、刘腾腾、杨慧婷、单世娟、陈秋红、孙晓洁、杨桂文。7DB37/T4052—2020小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范1　范围本标准规定了小反刍兽疫（PPR）的恒温核酸扩增检测技术的要求。本标准适用于小反刍兽疫的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。2　规范性引用文件下列文件

3、对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法GB19489—2008　实验室　生物安全通用要求NY/T541—2016　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3　原理核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA，再依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下扩增。4　试剂或材

4、料除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。4.1　水：符合GB/T6682中规定的一级水。4.2　1×PBS溶液（pH值7.4）配制见附录A.1。4.3　核酸提取试剂：a)Trizol；b)氯仿；c)75%乙醇；d)异丙醇。4.4　恒温扩增试剂盒。4.5　不含RNA酶的水：DEPC处理过的不含RNA酶的水。4.6　恒温扩增检测引物：恒温扩增检测引物表B.1。4.7　无水乙醇。4.8　微量移液器配套的带滤芯吸头。4.9　离心管：1.5mL。5　材料及设备7DB37/T4052—2020主要

5、仪器设备：a)微量移液器：10μL、20μL、100μL、1000μL；b)高速台式离心机：离心力≥8000g；c)生物安全柜；d)冰箱；e)涡旋振荡器；f)研磨管；g)荧光定量PCR仪；h)天平：感量为0.001g。1　样品1.1　基本要求应符合GB19489—2008和NY/T541—2016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输的要求。1.2　样品采集1.2.1　棉拭子样品无菌采集羊口鼻棉拭子。1.2.2　组织样品无菌采集病死羊的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。2℃～8

6、℃低温运至实验室用于检测。1.2.3　环境样品采集与病羊相关场所的粪便、饲料、污水样品。2℃～8℃低温运至实验室。1.3　样品处理方法1.3.1　口鼻拭子样品处理口鼻拭子管6000g震荡45秒，取200μL进行核酸提取。1.3.2　淋巴结、脾、胸腺等组织样品处理取0.05g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000g震荡研磨45秒，制成约10%的组织匀浆液，5000g离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。1.3.3　粪便、饲料样品处理取1g的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，

7、6000g/min震荡研磨45秒，制成约10%的匀浆液，5000g/min离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。1.3.4　污水样品处理取200μL污水进行核酸提取。7DB37/T4052—20201　操作步骤1.1　RNA的提取–Trizol法1.1.1　取6.2处理后的样品向处理好的300μL组织样品或血清中加入800μLTrizol，重复吹打以裂解细胞（或者剧烈振荡），冰上放置10min～25min。1.1.2　加入氯仿200μL，用力振荡30s，室温放置5min。1.1.3　4℃

8、，8000g离心15min，吸取上层液体500μL于1.5mL离心管中。1.1.4　加入1.0mL异丙醇，-20℃沉淀RNA至少1h。1.1.5　4℃8000g离心10min，弃上清，用75%的乙醇洗涤沉淀，8000g离心5min，彻底弃去上清，自然条件下干燥沉淀，溶于50μLDEPC处理的灭菌水中，-20℃贮存，备用。也可选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。1.2　恒温核酸扩增设50μL恒温核酸扩增反应体系，详见附录B.2。1.3　检测每次反应设置阳性、阴性对照，具体反应程序见表