生物制药学第三章基因工程制药课件.ppt

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1、第三章　　基因工程制药第一节基因工程药物生产的基本过程DNA重组药物制造的主要步骤获得目的基因DNA的体外重组（切与连）载体的选择受体细胞的选择重组DNA分子转化（转）转化子的筛选与鉴定（选）外源基因的大规模表达和分离纯化产品的检验和制剂制备基因工程制药过程上游部分下游部分上游主要程序目的基因的获得和克隆重组载体的构建重组载体转入宿主细胞外源基因在宿中细胞中的表达表达产物的检测下游主要程序工程菌的发酵目的蛋白的分离纯化逐步加工成药品第二节常用表达系统一、大肠杆菌表达系统载体要求有自主复制起点筛选标记启动子，能被RNA聚合酶识别终止子翻译起始信号多克隆位点

2、pBV220系统pET系统pBV220质粒菌株DH10BJM109DH5αpET质粒菌株BL21DE3二、酵母表达系统原核筛选标记真核转录和表达元件，包括启动子、终止字、翻译起始信号真核复制起始位点或整合位点真核筛选标记载体要求原核复制起始位点啤酒酵母表达系统毕赤酵母表达系统裂殖酵母表达系统汉逊酵母表达系统Invitrogen公司的pYES2质粒，含2μ复制序列和pUC复制起点，Amp和Ura筛选标记，GAL1启动子和CYC2终止子pPIC9K全长9.3Kb，原核有氨苄和卡那抗性，真核中是组氨酸和HG418筛选标记，有和染色体重组的整合位点，在多克隆位点

3、的上游有信号肽序列，用甲醇诱导表达pYES2半乳糖激酶启动子pPIC9K甲醇氧化酶启动子目前已发现的、最强的真核启动子第三节基因工程制药上游技术一、目的基因的获得1.化学合成法在核酸合成以上可以自动合成一条单链的寡聚核苷酸，准确率比较高，但是费用也高2.PCR法如果知道基因序列，且基因没有内含子，就可以通过合成引物，通过PCR的方法人工合成基因3.逆转录法对有内含子的基因常采用的方法，具体工程为：提取细胞或组织的总RNA，用逆转录酶和OligodT合成cDNA的第一链，再通过PCR方法合成第二连二、目的基因的克隆一般是将目的基因连接到T载体上，但有时候这

4、一步可以省略三、基因的体外重组双酶切T载体和表达载体，体外连接四、重组产物转入到宿主菌中体外连接的产物，用合适的方法转入到宿主菌中，如用氯化钙或电转化法转入到大肠杆菌中，酵母的转化还要经历大肠杆菌阶段五、外源基因的表达根据启动子的类型，采用不同的表达条件，如pET系统，用IPTG或乳糖诱导，pBV220系统采用温度诱导，毕赤酵母用甲醇诱导六、目的蛋白的检测一般采用活性试验和/或电泳菌体总蛋白质第四节基因工程制药上游过程实例实例一引物，PCR扩增PCR产物连接到T载体上转化到大肠杆菌T载体双酶切表达载体双酶切体外连接转化到大肠杆菌提取质粒转化到表达宿主菌诱

5、导表达电泳检测蛋白实例二引物，PCR扩增PCR产物连接到T载体上转化大肠杆菌T载体双酶切表达载体双酶切体外连接转化大肠杆菌提取质粒转化到酵母中活性检测实例三鲨鱼肝总RNAOligodT逆转录第一链鲨肝活性肽N端序列，OligodTcDNA双链连接到T载体上双酶切T载体和表达载体体外连接两个片段转化到大肠杆菌中测序，与多肽序列对照诱导表达电泳检测分子量，活性试验第五节基因工程菌的稳定性工程菌的不稳定性大多数是由于质粒不稳定造成的一、工程菌的稳定性质粒分裂的不稳定:工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象质粒结构的不稳定:指外源基因从质粒上丢失或者碱基重

6、排、缺失而导致的工程菌性能的改变1.质粒不稳定产生的原因含质粒菌产生不含质粒菌的比率两种菌的比生长速度差异的大小插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构2.提高质粒稳定性的方法两阶段培养法发酵工艺条件的优化选择合适的宿主菌或质粒增大选择压力固定化技术两阶段培养法菌体生长的一定阶段的时候，进行诱导表达大肠杆菌的pET系统毕赤酵母发酵工艺条件的优化通过适当发酵工艺，可以提高质粒的稳定性，可以间隙改变发酵的环境参数，如温度、溶氧量、酸碱度等选择合适的宿主菌或质粒根据表达蛋白的性质，选择合适的宿主菌和质粒搭配pET系统中的宿主菌有BL21、DE3、DH10B等，质粒

7、有pET－3、5、12、14、、17、21、22、25、28、32、34、40等相对而言，Kan抗性的质粒一般比Amp抗性稳定增大选择压力Amp的工作浓度一般在50μg/ml，发酵培养是可以加大到200μg/ml固定化技术将细胞固定在载体上进行培养第六节重组蛋白高表达策略一、大肠杆菌表达系统1.外源基因的拷贝数2.外源基因的表达效率3.表达产物的稳定性4.细胞的代谢负荷5.发酵条件的优化外源基因的拷贝数一般情况下，菌体内质粒的拷贝数越多，外源基因就越多，转录的RNA也就越多，翻译出来的蛋白也就越多外源基因的表达效率就目前人们的认识水平，许多因素影响外源基

8、因的表达效率启动子核糖体结合位点SD序列起始密码子ATG的距离密码子的组成表达产