hxy-生物制药学实验

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1、实验一碱裂解法小量制备质粒DNA（4学时）一、实验目的1.了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的广泛应用2.学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和操作方法二、实验原理质粒（plasmid）是细菌细胞内的一种共价闭合环状DNA（简称cccDNA）分子，作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状，能传给子代并在子代细胞中保持一定的拷贝数，也可丢失及在细菌之间转移。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的载体，可通过连接外源基因

2、构成重组体。从宿主菌中提取质粒DNA是DNA重组技术中最基础的实验技能。质粒抽提的方法很多，但原理和操作步骤都大同小异，以碱裂解法最为常用。碱裂解法提取质粒是根据质粒的cccDNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。使用SDS和强碱处理裂解细菌细胞后，在pH值介于12.0～12.5这个范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，然而cccDNA的氢键虽会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液将pH值恢复至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子

3、，并以溶解状态存在于液相中。而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，和不稳定的大分子RNA，变性的蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来，从而可以通过离心去除。三、试剂和器材试剂1.LB液体培养基胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L，调pH至7.0，高压灭菌。2.LB+Amp培养基LB液体培养基内加入50μg/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60℃时加入。3.溶液Ⅰ（50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,pH8.0）称取0.3gTris，

4、0.37gEDTA二钠盐，用适量双蒸水溶解后用HCl调pH至8.0，定容到100mL，再加入0.99g葡萄糖。4.溶液Ⅱ（0.2MNaOH,1%SDS）称取0.8gNaOH和1gSDS溶于双蒸水，定容至100mL，现配现用。5.溶液Ⅲ([K+]=3M,[Acˉ]=5M)取5mMKAc溶液60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL混匀。6.TE缓冲液（10mMpH8.0Tris-HCl，1mMEDTA）称取0.12gTris，0.037gEDTA二钠盐,加适量双蒸水溶解，用HCl调至pH8.0并定容至100mL，高压湿热灭菌，4℃保存备用。7.无水乙

5、醇和70%乙醇8.酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）9.RNaseA（10mg/mL）称取不含DNA酶的RNaseA0.1g，溶于10mLTE中，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。材料携带质粒（pET32a质粒）的大肠杆菌器材灭菌锅、恒温摇床、离心机、微量移液器、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。四、实验步骤(一)细菌的培养将含有质粒的大肠杆菌接种于LB+Amp液体培养基中，250r/min，37℃摇床培养过夜。(二)质粒提取1.取1.5mL培养液加入Eppendorf管中，5000r/min离心3mi

6、n。弃去上清，保留菌体沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，手机菌体。2.将菌体沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，盖紧管口，充分振荡混匀，室温放置5-10min。3.加入200μL新鲜配制溶液Ⅱ，盖紧管口，颠倒数次轻柔混匀(勿剧烈震荡)，此时菌液应该变得清亮，，将离心管放冰上5min。4.加入150μL冰上预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和颠倒数次使混匀，此时出现白色絮状沉淀。冰上放置5-10min。5.4℃，12000r/min离心10min，将上清转至另一Eppendorf管中。6.向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），反复混匀，12000

7、r/min离心10min，将上清转移到另一Eppendorf管中。7.向上清加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，室温放置15-20min。12000r/min离心10min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干管壁粘附的液体。8.加入1mL70%乙醇洗涤沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥，即得到质粒DNA制品。9.将DNA溶于30μLTE（含有20μg/mL的RNaseA）中，-20℃保存，备用。五、注意事项1.细菌培养过程中要求无菌操作。枪头、离心管等都需要灭菌。2.制备质粒的过程中，注意操作缓和，以避免机械剪切力对DNA的损伤

8、。3.加入溶液III后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA被包埋在沉