欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:33618826
大小:173.50 KB
页数:9页
时间:2019-02-27
《hxy-生物制药学实验》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、实验一碱裂解法小量制备质粒DNA(4学时)一、实验目的1.了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的广泛应用2.学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和操作方法二、实验原理质粒(plasmid)是细菌细胞内的一种共价闭合环状DNA(简称cccDNA)分子,作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的染色体之外,质粒DNA上携带了部分的基因信息,经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状,能传给子代并在子代细胞中保持一定的拷贝数,也可丢失及在细菌之间转移。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的,常含抗生素抗性基因,是重组DNA技术中重要的载体,可通过连接外源基因
2、构成重组体。从宿主菌中提取质粒DNA是DNA重组技术中最基础的实验技能。质粒抽提的方法很多,但原理和操作步骤都大同小异,以碱裂解法最为常用。碱裂解法提取质粒是根据质粒的cccDNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。使用SDS和强碱处理裂解细菌细胞后,在pH值介于12.0~12.5这个范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,然而cccDNA的氢键虽会被断裂,但两条互补链彼此相互缠绕,仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液将pH值恢复至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性,DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子
3、,并以溶解状态存在于液相中。而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,和不稳定的大分子RNA,变性的蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,从而可以通过离心去除。三、试剂和器材试剂1.LB液体培养基胰蛋白胨10g/L,酵母抽提物5g/L,NaCl10g/L,调pH至7.0,高压灭菌。2.LB+Amp培养基LB液体培养基内加入50μg/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解,待培养基温度低于60℃时加入。3.溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,pH8.0)称取0.3gTris,
4、0.37gEDTA二钠盐,用适量双蒸水溶解后用HCl调pH至8.0,定容到100mL,再加入0.99g葡萄糖。4.溶液Ⅱ(0.2MNaOH,1%SDS)称取0.8gNaOH和1gSDS溶于双蒸水,定容至100mL,现配现用。5.溶液Ⅲ([K+]=3M,[Acˉ]=5M)取5mMKAc溶液60mL,冰醋酸11.5mL,H2O28.5mL混匀。6.TE缓冲液(10mMpH8.0Tris-HCl,1mMEDTA)称取0.12gTris,0.037gEDTA二钠盐,加适量双蒸水溶解,用HCl调至pH8.0并定容至100mL,高压湿热灭菌,4℃保存备用。7.无水乙
5、醇和70%乙醇8.酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)9.RNaseA(10mg/mL)称取不含DNA酶的RNaseA0.1g,溶于10mLTE中,沸水加热15min,分装后贮存于-20℃。材料携带质粒(pET32a质粒)的大肠杆菌器材灭菌锅、恒温摇床、离心机、微量移液器、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。四、实验步骤(一)细菌的培养将含有质粒的大肠杆菌接种于LB+Amp液体培养基中,250r/min,37℃摇床培养过夜。(二)质粒提取1.取1.5mL培养液加入Eppendorf管中,5000r/min离心3mi
6、n。弃去上清,保留菌体沉淀。如菌量不足可再加入培养液,重复离心,手机菌体。2.将菌体沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中,盖紧管口,充分振荡混匀,室温放置5-10min。3.加入200μL新鲜配制溶液Ⅱ,盖紧管口,颠倒数次轻柔混匀(勿剧烈震荡),此时菌液应该变得清亮,,将离心管放冰上5min。4.加入150μL冰上预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,温和颠倒数次使混匀,此时出现白色絮状沉淀。冰上放置5-10min。5.4℃,12000r/min离心10min,将上清转至另一Eppendorf管中。6.向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),反复混匀,12000
7、r/min离心10min,将上清转移到另一Eppendorf管中。7.向上清加入2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀后,室温放置15-20min。12000r/min离心10min。倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干管壁粘附的液体。8.加入1mL70%乙醇洗涤沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥,即得到质粒DNA制品。9.将DNA溶于30μLTE(含有20μg/mL的RNaseA)中,-20℃保存,备用。五、注意事项1.细菌培养过程中要求无菌操作。枪头、离心管等都需要灭菌。2.制备质粒的过程中,注意操作缓和,以避免机械剪切力对DNA的损伤
8、。3.加入溶液III后,可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物,防止质粒DNA被包埋在沉
此文档下载收益归作者所有