生物制药学实验指导（自编）

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1、第一篇单克隆抗体技术抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结介的免疫球蛋白，常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血淸通常含有针对其他无关抗原的抗体和血淸中其他蛋口质成分。-•般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成，因而，常规血清抗体乂称多克隆抗体，简称多抗。rti丁•常规抗体的多克隆性质，加Z不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针対预定抗原的特杲性均质

2、的口能保证无限屋供应的抗体是免疫化学家梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术。他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限量牛氏的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种朵交瘤细胞具冇双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养屮能无限地快速增殖且永生不死，乂能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到來自单个杂交瘤细胞地单克隆系，即朵交瘤细胞系，口所产生的抗体是针对同一-抗原决立簇的高度同质的抗体，即所谓单克降抗体，简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一

3、性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带來了免疫学领域里的一次革命，而H它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。H前全世界正在研制的生物技术药品，其中25%为各类单克隆抗体，2010年世界单克降抗体药物的销售额可达200亿美元，现在全世界所有的人型制药公司和100多个中小生物技术公司，无一不涉足单克隆抗体药物的研究与开发。据美国制药丄业协会的调杳报告显示，单克隆抗体药物居所有医药牛物技术产品Z首。单克隆抗体作为抗体制剂，在临床实践中主要用于疾病的诊断和治疗两个方面。如利用单克降抗体检测与某些疾病冇关的抗原，辅助

4、临床诊断，或用放射性核素标记单克隆抗体进行•肿瘤显像，做免疫定位诊断。单-克隆抗体制剂也用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3(clusterofdifferentiation,CD3)的单克隆抗体，因其对器官移植排斥反应有显著的抑制效果，川作免疫抑制剂已在美国批准上市。以单克隆抗体作为载体的药物可对肿瘤进行定向治疗。单克隆抗体药物口益显示出广阔的应用前景。制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个刀的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，以制备抗猪TgG

5、单克隆抗体为例逐一•介绍其实验方法。实验一免疫抗原的制备及BALB/c小鼠的免疫1.抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯。但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须対抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也町是不同的纯度，这

6、主要决定于所用筛选方法的种类及其特异性和敏感性。1.免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞町选用小鼠和大鼠作为免疫动物，因为，所用的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均來源于BALB/c小鼠，所用的大鼠骨髄瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗休的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时间以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。2.免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异性抗原刺激下分化、增

7、殖，以利于细胞融介形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能使用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表1-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，IT前尤其推崇后者，因为对使抗原对脾细胞作用更迅速

8、佃充分。在最后一次加强免疫后笫3天取脾融合为好。表1T不同免疫抗原的免疫程

9、序免疫原特性抗原量接种次数间隔时间单抗滴度单抗亲和性免疫原性强（如