第三讲利用基因芯片进行基因表达谱分析ppt课件.ppt

《第三讲利用基因芯片进行基因表达谱分析ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、利用基因芯片进行基因表达谱分析第三讲RNA的检测:表达丰度，剪切体DNA的检测：SNP，CGH，MethylationcDNA芯片的主要用于：表达谱芯片，CGH寡核苷酸芯片主要用于：诊断芯片，SNP分型芯片基因芯片应用MoreMicroarrayApplicationsChromosomesDNAGenepromotersmRNAmRNAvariantsmicroRNAsaCGHSNPsmiRNADNARNASNPsChIP/LAmiRNAGeneExpressionAlternateSplicing双色荧光系统cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核苷酸芯片实验组及对照组

2、两种组织的mRNA在反转录成cDNA的过程中分别标记上Cy3和Cy5两种荧光，制备成探针，竞争性地与芯片上的核酸片段进行杂交两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量，通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中基因表达是否有变化。数据分析、寻找差异表达的基因Cy3标记的A组织mRNACy5标记的B组织mRNA混合探针以两种波长的激光扫描Cy3-532nmCy5-635nm杂交双荧光系统芯片的原理及流程图单色荧光系统较短的寡核苷酸芯片如Affymatrix芯片；载有较长片段的寡核苷酸芯片也可使用，如Illumina芯片实验组和对照组

3、分别用同样的荧光物质标记（或生物素biotin），分别与芯片杂交，即一张芯片只杂交一个样本根据杂交结果判断待测样品同芯片上哪个片段结合，通过与对照组的比较转化成基因表达的改变数据分析、寻找差异表达的基因探针A：biotin标记扫描杂交探针B：biotin标记两张芯片上相同位点信号比单荧光系统芯片的原理及流程图单通道和双通道的比较单通道实验结果重复性更好，使得比较不同样品之间各种基因表达的相对比例是可靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的比较时，只需在多个样本中设置对照。由于点样的是寡核苷酸，探针无法检测。双通道（点样cDNA）重复性相对较差，但是探针可以测序验证。双色法需在

4、每次杂交检测中设置对照，只能进行两个样品之间的比较，芯片之间的比较并不可靠ExpressionAnalysisArrays（Affymetrix)UniquePM-MMProbeDesign11-20pairsof25merprobe3´5´AAAAA3’UTREachgeneisrepresentedontheprobearraybymultipleprobepairsEachprobepairconsistsofaperfectmatchandamismatcholigonucleotidePerfectMatchMismatchChipProbePairProbec

5、ellorfeaturePM-MM探针设计的优势灵敏度的提高将已克隆的转录产物以不同的浓度掺入到组织样品中。经过标记的样品与AffymetrixGenechip人类基因组芯片杂交，在克隆转录产物浓度低于8pM时，PM单独探针无法探测出相应的浓度变化，而与MM探针联合使用则可以探测出。单链和双链探针双链探针在液相条件下自我复性从而大大降低与固着的靶DNA杂交的机会，从而降低了探测灵敏度，因此需更多的探针量。单链，使杂交灵敏度提高基因芯片实验流程及方法cDNAmicroarrayTWOCHANNELMICROARRAYAffymetrixExpressionAnalysisR

6、everseTranscriptaseinvitrotranscriptionmRNAcDNAFragmentationofcRNAcRNAGeneChipHybridization标记实验过程样本制备样本标记预杂交杂交洗涤染色（如生物素标记）扫描数据分析HybridizationprocessofGeneChipLLLLabelingcRNAfragmentLLHybridizationmixtureEukaryoticHyb.ControlControlOligoB2hybridization（16hour）DataanalysisScanWash&stain样本制

7、备表达谱基因芯片研究的对象是样本中的mRNA，抽提出的mRNA需要经过反转录酶的作用转变为cDNA，同时进行荧光标记，标记好的cDNA靶分子就可用于杂交。基因芯片实验中的RNA抽提大都采用分子生物学中传统的方法，但要求必须能够尽可能多的抽提出组织中的RNA分子，保持实验数据信息与组织中mRNA拷贝数信息之间的平行性。mRNA的纯化方法两步法：从样本中制备总RNA，再从总RNA中分离mRNA,总RNA中包括rRNA、tRNA和mRNA，其中９０％以上是rRNA和tRNA，分离mRNA的原理一般利用真核生物的mRNA的３’端都有p