第六章 重组子的筛选与鉴定ppt课件.ppt

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1、一、载体表型选择法二、根据插入基因的表型选择三、DNA电泳检测法四、PCR检测法五、核酸杂交检测法六、免疫化学检测法七、DNA序列分析第三节重组子的筛选与鉴定（一）抗药性标记及其插入失活选择法一、载体表型选择法利用载体分子上抗药性标记基因对克隆子进行筛选。氨苄青霉素（ampicillin,Ap或Amp)氯霉素（chloramphenicol,Cm或Cmp)卡那霉素（kanamycin,Kn或Kan)四环素（tetracymic,Tc或Tet)链霉素（strentomycin,Sm或Str)（一）抗药性标记及其插入失活选择法Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI

2、和SalI;Ampr上有插入位点PstI。一、载体表型选择法1、pBR322质粒上有两个抗性基因:（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2、pBR322抗菌素标记选择产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：3.选择过程：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分

3、裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。（二）-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并

4、且没有中止密码；（不破坏肽）。2.选择过程-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。二、根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长例：抗生素抗性抗性基因载体外源DNA连接转化受体菌抗生素培养基平板含抗生素抗性基因的克隆才能生长使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。1.直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。三、DNA电泳检测法Marker

5、载体重组克隆2.酶切电泳筛选法根据外源DNA序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶切割，电泳后比较电泳结果：DNA带数和长度。一般用重组时的内切酶将外源DNA切出单双四、PCR扩增检测法应用PCR反应扩增出预期DNA片断（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）；（2）用外源DNA插入片断引物作PCR；（3）凝胶电泳；（4）是否有条带产生，条带大小是否正确。1.核酸杂交一、原理：重组克隆与探针杂交。3.识别标记32P或125I。（1）放射性同位素2.检测用的探针与外源DNA插入片断互补的序列。（2）非放射性标记荧光素五、核酸杂交检测法特点:无放射性污染，灵敏度高，保存期长地高辛

6、(Digoxigenin)标记探针生物素标记探针特点：无放射性，试剂稳定，保存期长，价格便宜，但灵敏度较低（5104拷贝）。二、核酸杂交检测方法用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。1.Southernblotting从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。纪念发明者——EdwardSouthern流程:（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析1.Southernblotting酶切前酶切后插入片断载体Sou

7、thernblot筛选结果2.Northernblotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。Northernblotting操作过程mRNA的提取甲醛变性胶电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态3.原位杂交筛选定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交