副溶血性弧菌检验标准操作程序.ppt

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1、副溶血性弧菌检验标准操作程序概　况副溶血性弧菌于1950年从日本一次暴发性食物中毒中分离发现。该菌存在于近海的海水、海底沉积物和鱼类、贝壳等海产品中。在37℃、pH7.7、含氯化钠3～4%的环境中生长最好。主要引起食物中毒，尤以日本、东南亚、美国及我国台北地区多见，也是我国大陆沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。范　围本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）的检验方法。本标准适用于水产品及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验，其他食品可参照使用。食品种类动物性水产品：鲜

2、冻水产品（定性检测）：新鲜水产品和冷冻水产品；生食水产品（定性、定量检测）：新鲜的、冷藏、冷冻的海水或淡水鱼类、甲壳类、贝壳类和软体动物等，未经腌制、加热，可以直接食用的。设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：•恒温培养箱：36℃±1℃。•冰箱：2℃～5℃。•均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。•天平：感量0.1g。•无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm。•无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。•无菌锥形瓶：5

3、00mL、250mL。•无菌培养皿：直径90mm。•VITEK全自动微生物鉴定系统[1]。•灭菌手术剪、镊子。样品制备•非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻；如果样品需要冷冻贮存，应在样品中加等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），推荐贮存温度为-70℃以下。样品制备鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；样品制备甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。样品制备如为带

4、壳贝类或甲壳类，则应先在符合生活饮用水卫生标准的流水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。样品制备以无菌操作取检样25g（mL），加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1min，或拍击式均质器拍击2min，制备成1:10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在500mL的灭菌容器内，加225mL3％氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。增菌定性检测将上述1:10稀释液于36℃±1℃培养8h～18h。增菌定量检测用灭

5、菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置36℃±1℃恒温箱内，培养8h～18h。分离在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCBS平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管

6、划线一块平板。于36℃±1℃培养18h～24h。使用TCBS琼脂划线不可密集分离典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈现为圆的、半透明的、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm～3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上呈现为圆的、半透明的、表面光滑的粉紫色菌落，直径2mm～3mm。TCBS琼脂上面的副溶血性弧菌四种显色培养基纯培养挑取3个或以上的可疑菌落，划线3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1

7、℃培养18h～24h。初步鉴定氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。初步鉴定涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。初步鉴定挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3％氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。TSA＋TTC可以方便观察副溶血性弧菌动力初步鉴定嗜盐性试验：挑

8、取纯培养的单个可疑菌落，分别接种于不同氯化钠浓度的胰胨水中，36℃±1℃培养24h，观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10％氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在7％氯化钠的胰胨水中生长旺盛。确定鉴定生化试验：分别接种含3％氯化钠的甘露醇、赖氨酸、MR-VP培养基，36℃±1℃培养24h～48h后观察结果。隔夜培养物进行ONPG试验。MR-VP试验ONPG试验确定鉴定API20E生化鉴定试剂盒或VITEK：刮取3％氯化钠