核酸杂交原理课件.ppt

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1、核酸分子杂交技术与应用一、杂交的基本原理杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的(病毒）探针和待测样品中的病毒核酸,杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号,则说明样品中存在（病毒）核酸,进而证明病毒感染的存在。DNA探针：是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可用来快速检测病原体。一、杂交的基本原理一、核酸分子杂交的基本原理与分类（一）核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）（1）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链

2、解链成为单链。（2）.引起核酸变性的因素酸碱热变性剂（尿素）有机溶剂（乙醇）2、杂交2条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。分类DNA-DNADNA-RNARNA-RNA3、复性变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素：DNA浓度DNA片段的大小DNA片段复杂性合适的复性温度适当的离子强度（1）制备样品：首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA。（2）制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。（3）预杂交和杂交（4）检测杂交结果一、核酸分子杂交的基本原理

3、与分类（二）核酸分子杂交的基本步骤二、核酸探针（一）探针的概念探针（probe）指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。DNA探针将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针。可与固定在硝酸纤维素膜的DNA或RNA进行互补结合，经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。（二）探针种类和选择1.探针种类（1）基因组DNA探针为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。（2）cDNA探针以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的

4、DNA链。（3）RNA探针以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。（4）寡核苷酸探针三、探针标记原理与方法理想的探针标记物应具备①高度的敏感性②标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基配对及探针分子的主要理化性质；③检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳性绿低外，尚需考虑环境污染少，价格低；④若用酶促方法标记，应对酶的Km值影响不大，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性。（一）、标记物放射性同位素标记物非放射同位素标记物1.放射性同位特点：●放射自显影技术检测，信号的强弱通过计数银粒的多少易于进行定量分析。主要缺点射线

5、对人体有伤害放射性物质需特殊的处理半衰期短不宜存放使用2.非放射性标记物常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素。特点：敏感性不如同位素标记稳定性和分辨率高检测时间短操作简便不需特殊的防护设备不存在放射性污染四、杂交与杂交后检测（一）核酸分子与固相介质的结合1、支持介质的类型和性质硝酸纤维薄膜：本底低，易检测杂交信号对小于500碱基的核酸结合力低，脆性大易破裂。尼龙膜和带电荷的尼龙膜：耐用，结合力强，但其本底高。（二）核酸分子的转移1、噬菌体/克隆的转移2、从凝胶上转移DNA（1）毛细转移（2）真空转移（3）电转移（三）核酸的固定

6、1、烘烤80℃2小时2、紫外光固定3、碱固定（四）杂交1、预杂交（1）目的：减少非特异性杂交（2）成分：去污剂：1%SDS（可促进溶液对薄膜的覆盖，可抑制RNase酶活性）封闭剂：Denhard氏溶液2、杂交影响杂交的因素◇温度：DNA之间的杂交反应通常在68℃进行,当含50%变性剂甲酰胺,则在42℃进行。◇盐离子浓度：离子浓度与杂交速率成正比；与杂交稳定性也成正比。◇甲酰胺：可降低Tm值。◇DNA浓度：高浓度双链DNA及探针◇碱基组成：探针的Tm高，杂交速率快◇错配的核酸序列：错配降低杂交速率。◇杂交的时间：一般来说,杂交时间通常在2～16小时。3、洗脱除去溶液未反应的探针与滤膜疏

7、松结合的探针非特异性结合的探针（五）杂交信号的检测放射自显影非放射性杂化分子的检测1、菌落杂交用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。主要步骤：菌落平板培养滤膜灭菌后放到细菌平板上菌落粘到滤膜上滤膜放到杂交液中探针杂交检测五、常用的杂交技术2、Southern印迹杂交膜上检测DNA的杂交技术，1975年由EdwinSouthern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性