马铃薯早疫病菌的分子鉴定与田间早期诊断-论文.pdf

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1、第4O卷第4期植物保护学报Vo1．40No．42013年8月ACTAPHYTOPHYLACICASINICAAug．2013马铃薯早疫病菌的分子鉴定与田间早期诊断AmethodformoleculardetectionofAlternariasolanianditsapplicabilitytoearlydiagnosisofpotatoearlyblightinthefield／郭倩倩杨志辉崔亚婧徐进朱杰华(河北农业大学植物保护学院，保定071000)GuoQianqianYangZhihuiCuiYajingXuJinZhuJieh

2、ua(CollegeofPlantProtection，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，HebeiProvince，China)马铃薯早疫病由茄链格孢Alternariasolani引1．2方法起，通常导致产量损失达30％以上¨。目前关于特异性引物的设计：根据GenBank上下载的链马铃薯早疫病菌的鉴定主要是基于形态特征进行。格孢属的ITS序列，设计鉴定马铃薯早疫病菌的然而，该病菌在离体培养时不易产孢，增加了鉴定的特异性引物。利用ClustalX1．81[33进行序列比对，难度。马

3、铃薯早疫病的早期诊断在早疫病防控中占BioEdit7．0．9．0对序列进行调整，并通过Primer有重要地位，建立马铃薯早疫病菌的分子鉴定和早Premierv5．0进行引物设计。于上海生工生物技术疫病的田间早期诊断技术将有助于防控措施的制有限公司合成。定。本研究选择ITS序列作为早疫病菌分子鉴定的DNA的提取和PCR扩增：采用CTAB法提取目标区域，通过ITS序列分析设计马铃薯早疫病菌病原菌DNA，采用玻璃珠振荡法提取田间叶片的特异性引物，建立早疫病菌的分子鉴定技术并探DNA，DNA均于一20℃冰箱中保存备用。PCR扩增索早疫病早期诊断

4、技术。体系为25，含2×TaqPCRMasterMix12．5、101材料与方法p~moL／L引物各1．0L、模板DNA10ng、ddH209．51．1材料L。反应程序：95℃预变性lmin；95oC变性30S，50马铃薯早疫病菌Alternariasolani、晚疫病菌℃退火30S，72℃延伸23S，共35个循环；72℃延伸Phytophthorainfestans、黑痣病菌Rhizoctoniasolani、7min。反应结束后，取1PCR产物在1％(0．5X干腐病菌Fusariumsambucinum、环腐病菌Clavibacte

5、rTBE)琼脂糖凝胶上以110V电压电泳30min。michiganensissubsp．sepedonicus和黑胫病菌Pectobac—2结果与分析teriumatroseptica及链格孢属Alternaria的相关种黄2．1马铃薯早疫病菌的分子鉴定：根据ITS序列比金树链格孢A．catalpae、藜生链格孢A．chenopodiico对结果，找到早疫病菌的种间变异、种内保守区域，、姜链格孢．sp．和苘麻链格孢A．abutilon~均为确定鉴定早疫病菌的特异性引物为ptAs—F(5．CAC．河北农业大学马铃薯病害研究实验室分离保存

6、。供CTCCCGGGGTGGCCA-3)和ptAs-R(5'-CCCGCAAG-试植株病叶于河北省围场县马铃薯早疫病试验田采GGGAGACAAA一3)。预期的扩增产物长度为358集，分别为侵染初期(只有1个直径为1mm侵染点)、bp。利用特异性引物对各种病原菌进行PCR扩增。侵染中期(病斑直径为3～4mm)、侵染后期(病斑直以无菌水作为阴性对照。仅早疫病菌扩增出了与预径大于7mm)的发病叶片以及温室控制条件下培养期长度一致的358bp的特异性条带，而其它病原菌的健康叶片。所采集叶片用灭菌蒸馏水进行清洗、均无PCR扩增产物(图1)。表明该

7、引物对马铃薯晾干后备用。DNAmarker2000、2×TaqPCRMaster早疫病菌具有特异性。Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司。2．2马铃薯早疫病的田间早期诊断：对侵染初期、基金项目：现代农业产业技术体系建设专项(CARS．10一P12)作者简介：郭倩倩，女，1987年生，硕士研究生，研究方向为分子植物病理学，E-mail：guoqianqian870812@126．con{通讯作者(Authorforcorrespondence)，E-mail：zhujiehua356@126．corn，Tel：0312—7528175收

8、稿日期：2013—03—11