马铃薯早疫病的分子检测及田间早期诊断

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1、分类号：兰垒圣墨：圣呈密级：韭蜜单位代码：!QQ璺鱼学号：星Q!Q兰旦Z马铃薯早疫病的分子检测及田间早期诊断AmethodformolecluardetectionofAlternariasolanianditsapplicabilitytoearlydiagnosispotatoearlyblightinfield学位申请人：郭倩倩指导教师：朱杰华教授杨志辉副教授学科专业：植物病理学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一三年五月二十九日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及

2、取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北壅业大堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：却侑债签字日期：彬年P月弓1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑皇垦壑些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑皇垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数

3、据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：智倚钨导师签名：签字日期：弗年上月期日签字日期：邳年●月古7日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：摘要茄链格孢离体条件下不易产孢，很难利用传统的形态学方法进行病原菌检测；同时，马铃薯早疫病早期症状的田间观察非常困难。本研究在对病原菌基因组序列分析的基础上，开发出一对PCR引物，利用PCR技术，建立了能够检测马铃薯早疫病菌，进而诊断早期田间病害的分子生物学技术。利用该技术，可以快速、

4、准确、灵敏地检测到马铃薯早疫病菌，并能够在病害发生初期对病害进行监测。因此，建立马铃薯早疫病的早期诊断技术对制定病害防控措施具有重要意义。主要研究结果如下：1．建立了对马铃薯早疫病菌特异的PCR检测技术。通过对链格孢属核糖体基因内转录间隔区(ITS)的序列同源性分析，设计出一对检测茄链格孢的特异性PCR引物ptAs-F：5’一CACCTCCCGGGGTGGCCA-3’和ptAs-R：5'-CCCGCAAGGGGAGACAAA．3’；并优化了PCR扩增体系，50℃退火30S，72℃延伸23S，共35个循环。利用引物对扩增后早

5、疫病菌可获得长度为358bp的特异条带，而在引起马铃薯真菌和细菌病害的病原菌及相关的链格孢种均未扩增出该条带，表明该引物对对马铃薯早疫病菌具有特异性。该方法的灵敏度在病原菌基因组DNA水平上的最低检测浓度为1．0ng／}tL；在病原菌孢子数水平上的最低检测浓度为105个／mL。同时，该方法还可以对早疫病菌的扩散进行检测，随着病斑的扩展，检测到的条带不断增多，条带的亮度也不断增加。2．建立了田间早期诊断马铃薯早疫病的新方法。采用改进的玻璃珠振荡法提取马铃薯叶片组织中病原菌DNA，利用引物ptAs．F／ptAs．R进行PCR扩

6、增，从得到叶片样品到获得叶片是否被茄链格孢侵染的检测结果，仅需2．5h。利用该方法，可以从处于潜育期的未显症叶片组织中特异性地检测到马铃薯早疫病菌，为田间病害的早期、快速诊断提供技术支撑。3．利用上述建立的方法，于2013年4月16日分别对滕州市姜屯镇张寨村常年种植马铃薯的3个不同田块采集的侵染初期和发病复叶上未显症的60片马铃薯叶片进行早疫病发病及潜育情况的检测。早期田块下部叶片病菌侵染率分别为90．3％、61．7％和48．3％，即田块I被侵染的程度最高，II其次，III最轻。相应地，5月3日各田块的后期病叶率依次为91

7、．4％、62．8％和49．6％，病情指数分别为24．8、10．9和7．5，与早期检测结果一致，验证了本研究建立的马铃薯早疫病田间早期诊断方法的准确性、可靠性。关键词：茄链格孢；ITS；DNA提取法；PCR；分子检测；早期诊断AmethodformolecluardetectionofAlternariasolanianditsapplicabilitytoearlydiagnosispotatoearlyblightinfieldMastercandidate：GuoQian—qianMajor：PlantPatholog

8、ySupervisor：ProfessorZhuJie—huaAssociateprofessorYangZhi—huiAbstractPotatoearlyblightiscausedbyAlternariasolani．However，tradlitionalmorphologymethodiSha