厌氧氨氧化菌种的低温保藏条件.pdf

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1、第13卷第2期杭州师范大学学报(自然科学版)Vo1．13NO．22O14年3月JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Mar．2014厌氧氨氧化菌种的低温保藏条件诸美红，姬玉欣，叶小青，彭亭瑜，金仁村(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036)摘要：剖析了厌氧氨氧化菌种低温保藏的影响因素，系统总结了保藏温度、保护剂(海藻糖、二甲亚砜、甘油等)、保藏时间、基质及活性恢复措施的设置要点．最后指出，保藏厌氧氨氧化菌种时需根据优势

2、菌的生理特性选择恰当的保藏条件．关键词：厌氧氨氧化菌；低温保藏；保护剂；温度中图分类号：X703．1文献标志码：A文章编号：1674—232X(2O14)02—0164—04厌氧氨氧化是以NH_+为电子供体，NO为电子受体生成N的微生物反应¨1j．厌氧氨氧化工艺因其高效节能备受学者关注．厌氧氨氧化菌作为厌氧氨氧化反应的核心载体，自20世纪90年代发现其存在于工业化的废水处理厂中而进一步将理论研究跨越到实际应用中[=2]．Arrigo等Ⅲ4学者发现厌氧氨氧化菌对海洋中氮去除的贡献率高达50．厌氧氨氧化菌倍增

3、时间长，增长缓慢，纯培养难以进行，因而应用于实际废水处理较困难．富集培养并有效保藏厌氧氨氧化菌种是解决其应用匮乏的有效措施．常见的菌种保藏方法有液体石蜡法、液氮法、冷藏法、冷冻法、冻干法及凝胶包埋法等．这些技术虽能在某种程度上有效保留细菌活性，如若应用于厌氧氨氧化菌的保藏过程，则不可避免地存有一定的弊端，如影响颗粒污泥形态、造成污泥结构变异等，厌氧氨氧化菌对温度变化比较敏感，选择合适的保藏温度至关重要，而低温保藏菌种避免了常温及较高温度下细菌自身的变化而应用较广，其中，冷藏和冷冻法最常见．海藻糖、二甲亚砜

4、(DMs())及凝胶作为低温保护剂，对菌种保藏起到一定的积极作用．厌氧氨氧化菌对环境条件苛刻的本性决定了需要寻求一种长远高效的保藏方法．然而，简单、快速有效的厌氧氨氧化菌保藏手段迄今为止未能发现，因而探讨外部环境因子对厌氧氨氧化菌种保藏效果的影响很有必要．本文主要探讨了保藏温度、保护剂、保藏时间、基质条件及活性恢复措施对厌氧氨氧化菌保藏效果的影响，以期为进一步优化厌氧氨氧化菌种保藏过程提供思路．1俅臧温度厌氧氨氧化菌对温度变化比较敏感，在正常进行厌氧氨氧化反应阶段，所需的最佳温度范围是6～收稿日期：201

5、3一O9—25基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目(201210346001)；国家自然科学基金项目(51078121)；杭州市科技发展计划项目(2O120433B20)通信作者：金仁村(1979)，男，副教授，博士，主要从事水污染控制和环境生物技术研究．Email：jrczju@aliyun．CO]J1第2期诸美红，等：厌氧氨氧化菌种的低温保藏条件l6543℃_5]．然而保藏厌氧氨氧化菌种时，保藏温度也会影响厌氧氨氧化菌的生存状态及后期恢复活性时的速度，因而选择恰当的保藏温度至关重要．在液氮中冷冻

6、及在4℃[6的牛奶培养基I7中保藏都可保持厌氧氨氧化菌处于活化状态．在4℃下保藏厌氧氨氧化菌聚集体是有效的，但对于诸如“CandidatusKueneniasf“g口鲫s”单一细胞菌群及海洋优势菌种“CandidatusScalindua”则相反，因为诸如上面2种单细胞菌在4℃下会随时间变化而发生细胞溶解l_8]．Vlaeminck等在研究长期保存限氧自养硝化一反硝化(OLAND)工艺中的微生物(好氧氨氧化菌和厌氧氨氧化菌)时，推荐保藏温度为4℃，4℃下不加硝酸盐，厌氧氨氧化菌活性为保藏前活性的55，而在

7、一2O℃下，未发现厌氧氨氧化菌有活性．此外，Gao等_g研究表明在4℃下长期稳定保藏好氧颗粒污泥有助于保全细胞结构完整性，而当保藏在一25℃下，恢复活性后的颗粒污泥沉降性能好，蛋白质与多糖的比例也无变化，说明颗粒污泥表面性质及形态未发生变化，进而推论一25℃下可有效保持细菌细胞内部微环境．由上可知，保藏温度的选取与自我需求有关，若想最大限度地保存菌体活性，可选择常温或4℃下保存，若想活性恢复后菌体内部微环境不受影响，则可选低温贮藏．另外，保藏温度也与菌种类型有关．2保护剂2．1海藻糖海藻糖(Trehalo

8、se)是生物组织的非特异性天然保护剂，属于非渗透性低温保护剂，可使动植物和微生物等有机体在冷冻、高温、脱水、高渗透压及有毒试剂等环境中仍保持生命活力．海藻糖可增强生物对外界恶劣环境的抗逆耐受力，在长期缺水环境中是维持生物生存的救命稻草，生物一旦进入水体又可快速恢复活性．海藻糖凭借着这种“特异功能”在诸多保护剂中脱颖而出，倍受学者关注．Vogelsang等。⋯发现利用干燥法保藏硝化污泥时，添加10mmol／I的海藻糖可显著增强微