条斑紫菜SAMS基因克隆与生物信息学分析.pdf

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（７）：４３～４９条斑紫菜ＳＡＭＳ基因克隆与生物信息学分析１１１２易乐飞王萍周向红刘楚吾（１淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室连云港２２２００５２广东海洋大学水产学院湛江５２４０８８）摘要干旱、高盐和低温是限制植物生长和农作物产量的主要逆境因子。Ｓ?腺苷甲硫氨酸合成酶（Ｓ?ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＳＡＭＳ）与植物抗逆境密切相关，而且超表达ＳＡＭＳ的转基因植物具有更高的抗干旱、高盐和低温能力。进行条斑紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａｙｅｚｏｅｎｓｉ

2、ｓ）Ｓ?腺苷甲硫氨酸合成酶基因（ＰｙＳＡＭＳ）ｃＤＮＡ的克隆及序列特征分析。首先利用电子克隆技术得到基因相关的ｃｏｎｔｉｇ，预测全长并设计引物，最后利用ＲＴ?ＰＣＲ技术成功克隆了ＰｙＳＡＭＳ的ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＦＪ４０４７４８）。该ｃＤＮＡ序列含有长１１５５ｎｔ的完整ＯＲＦ，编码蛋白（ＰｙＳＡＭＳ）分子量４１．８ｋＤａ，长３８４ＡＡ。ＰｙＳＡＭＳ与盘基网柄菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、莱茵衣藻（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）

3、和水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）等多种生物的ＳＡＭＳ具有较高的序列一致性，含有与ＳＡＭＳ酶活性密切相关的氨基酸残基和保守序列，与人（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）和大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）的ＳＡＭＳ具有高度相似的三维结构。所以ＰｙＳＡＭＳ与其它生物的ＳＡＭＳ一样，在条斑紫菜的抗逆过程中发挥重要作用。研究ＰｙＳＡＭＳ有助于阐明条斑紫菜耐受非生物胁迫的作用机理，有助于获得高抗逆转基因植物。关键词条斑紫菜Ｓ?腺苷甲硫氨酸合成酶克隆生物信息学中图分类号Ｑ７８干旱、高盐和低温是限制植物生长和农作物产量的ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎ

4、ｔｈｅｔａｓｅ，ＳＡＭＳ，ＥＣ２．５．１．６）基因主要逆境因子，克服干旱、高盐和低温对农业生产的制受多种非生物胁迫的诱导表达。例如甘薯（Ｉｐｏｍｏｅａ［３］约，培育具有良好抗逆特性的作物品种，一直是各国科学ｂａｔａｔｓ）ＳＡＭＳ基因受低温胁迫诱导表达；大洋洲滨藜家关注的焦点［１］。随着分子遗传育种的发展，利用抗逆［４］（Ａｔｒｉｐｌｅｘｎｕｍｍｕｌａｒｉａ）和西红柿（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ基因对作物进行基因工程改良已成为作物育种的重要途ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＭｉｌｌ．）［５，６］的ＳＡＭＳ基因受到盐胁迫诱导表［２］径并且成效显著。分离抗逆基因是基

5、因工程改良的第达；烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）的ＳＡＭＳ２基因受氧化胁一步。条斑紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）经过长期进化形成［７］迫、盐胁迫及高温胁迫诱导表达；盐地碱蓬（Ｓｕａｅｄａ了适应极端环境的抗逆基因和生理生化机制。自然条件ｓａｌｓａ）ＳＡＭＳ基因受ＮａＣｌ、ＡＢＡ及干旱胁迫的诱导表下，条斑紫菜叶状体生活在海水中；能在０．５℃的低温下［８］达；糜子（Ｐａｎｉｃｕｍｍｉｌｉａｃｅｕｍ）ＳＡＭＳ基因的表达涉及正常生长，－２０℃冷藏长达数月后，下海仍能复活并正常糜子响应干旱胁迫及干旱后复水过程，可能是糜子抗生长；能耐受长

6、达２至３天的缺水状态，即使被太阳晒干［９］旱节水的关键基因。ＳＡＭＳ基因与植物对干旱、盐碱发脆，涨潮后仍能正常生活。因此充分挖掘条斑紫菜的和低温的抗性密切相关，并协助植物耐受非生物胁迫。抗逆基因对作物的基因工程改良意义重大。ＳＡＭＳ催化ＡＴＰ和Ｌ?甲硫氨酸合成Ｓ?腺苷甲硫氨酸（Ｓ研究表明，Ｓ?腺苷甲硫氨酸合成酶（Ｓ?［１０］?ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＳＡＭ）。ＳＡＭ是生物体内重要收稿日期：２００８１１２４修回日期：２００８１２１０的中间代谢物，参与多种生化反应，在医学上ＳＡＭ被用国家科技支撑计划（２００７ＢＡＤ２９Ｂ０３）

7、、江苏省海洋生物技术重［１１，１２］点实验室开放课题（２００８ＨＳ００４）资助项目来治疗关节炎、忧郁症和急、慢性肝炎。ＳＡＭ在医通讯作者，电子信箱：ｌｉｕｃｗ＠ｇｄｏｕ．ｅｄｕ．ｃｎ药工业上应用日益广泛，需求量也日趋增大，工业上越４４中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２９Ｎｏ．７２００９［１３］来越多地使用ＳＡＭＳ酶促转化法生产ＳＡＭ。ｃＤＮＡ。ＰＣＲ反应体系为２５μｌ，其中含２．５μｌ１０×ＰＣＲ反目前已经在多种生物中克隆了ＳＡＭＳ基因，但尚无应缓冲液，１．７５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ，２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，上下

8、游２［１０］条斑紫菜ＳＡＭＳ基因（ＰｙＳＡＭＳ）的相关报道；本文以引物各０．５μｍｏｌ／Ｌ，４ＵＴａｑＰｌｕｓＩ，１μｌＲＴ产物为模板。