技术原理及方法课件.ppt

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1、PCR技术的原理和方法王文君广州中医药大学分子生物学技术实验室免疫研究室第七章PCR定义PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCR技术的基本原理一.PCR反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.4种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；

2、5.反应缓冲液、Mg2+等。二.PCR反应基本步骤：1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）5`——GGATCTAGCGTATGCTTGAAA——3`3`——CCTAGATCGCATACGAACTTT——5`模板DNA3’—GAACTTT—5’引物15’—GGATCTA—3’引物2图1PCR引物与模板结合示意图1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双

3、链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。模板DNA55℃退火70℃延伸25～30次循环目的片段扩增2n倍94℃变性图2PCR原理示意图引物1引物2模板PCR过程示意图目的基因增加2n20～30循环

4、94℃变性5’3’3’5’PCR反应体系成份终浓度10×buffer1/10体积Mgcl21.5～2.5mmol/LPrimer(2个）各0.2μmol/LdNTPs(4种）各200μmol/LBSA100μg/mLTaq酶1～2.5单位/反应体系模板DNA102～105个分子（100ng）纯水补至所需体积（25～50μl）第二节PCR扩增的基本方法PCR反应的成分和作用总体积：一般为25μl～100μl（一）无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度

5、，但不能超过50mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2+：终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。（三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10mmol/L，各成份以等当量配制，

6、反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但

7、应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。（七）引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能

8、与非目的扩增区有同源性。PCR反应条件的选择（影响因素）温度参数：1.变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于9