单分子操作及其应用解析课件.ppt

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1、单分子操作及其应用单分子操作技术单分子操作与研究应用存在的问题与解决途径单分子操作技术单分子操作技术是指应用一定的实验仪器和方法，在单分子水平上对生物大分子的行为（包括构象变化、相互作用、相互识别等）进行实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵﹑调控等，是纳米技术和分子生物物理学的自然延伸和必然趋势。它包括原子力显微镜（AFM）、玻璃微针、光镊和磁镊、单分子荧光光谱技术等。包含两个基本要素：测力或施力装置、生物分子的定位装置操作方式有两种：接触式，（如使用玻璃微针或AFM针尖），通过与连在DNA上的小球机械接触（或直接与生物分

2、子接触）来操纵分子；非接触式（如通过光场或磁场控制小球间接的操作生物分子），非接触式操纵方式测力范围较接触式小，但精度高，应用范围较广泛。单分子操作技术特点与经典的分子生物学技术相比，单分子操作技术避免了从大量实验结果中取平均的需要，因而可以提供更为详细的生物信息。是在单分子上进行的高效、直接、简便的操作单分子操作技术原理原子力显微镜技术——其目的是为了使非导体也可以采用扫描探针显微镜(SPM)进行观测，其通过探针与被测样品之间的微弱的相互作用力来获得物质表面的形貌。光镊技术——利用激光动量转移产生的辐射压力，从而形成具有

3、梯度力场的光学陷阱，处在陷阱中的微粒受到梯度力场的作用，就被“钳住”。可用于测量生物大分子间微弱的力以及生物大分子的很小位移。磁镊技术——是把生物分子的一端连接在载玻片上，另一端连上一个超顺磁性小球，外加一磁场吸引磁性小球，改变外磁场就可以拉伸或转动顺磁小球，从而拉伸或扭转生物分子，小球在其平衡位置附近做布朗运动其位置由光学显微镜记录玻璃微针——利用商业拉针仪器可以拉出比原子力显微镜微悬臂的弹性系数更小的微针尖，将针尖进行修饰连接上生物分子（一般是DNA）的一端，另一端连在一个可移动的精密样品台上，样品台拉伸DNA并使针尖

4、偏转，偏转量可以用来计算力单分子光谱技术——是将荧光基团标记在生物大分子上，标记在生物大分子上的荧光基团发生各种特性变化，通过光谱分析等就能够得到有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度以及在化学和静电环境下活性改变的信息。单分子操作技术的研究应用——核酸与蛋白质DNA拉伸与扭曲DNA凝聚核酸解链与从新折叠单分子酶学DNA拉伸核酸单分子操作研究起始于1992年Smith等对单个DNA分子的弹性测量。一段双链DNA分子的一端连接到玻璃表面上,另一端连接到磁性小球上，DNA分子连接到不同固体表面是通

5、过生物素--链霉抗生物素蛋白、地高辛免疫的特异反应来实现的；整个体系的组装在溶液中完成,在外加磁力的作用下,DNA被拉伸,借助于显微镜,就能测量到小球的位移。可以得到在不同盐浓度缓冲液中的单个DNA多聚体(48502个碱基对)的力-延伸曲线,并且在这个实验中力最大只增加到10皮牛顿。当大于60pN外加作用力作用于DNA上时，一个意想不到的现象出现了：双链DNA分子发生了70％的过度延伸。这种现象的出现是由于DNA发生了结构上的转变，转到了一个称之为s．DNA的时相。在Cluzel等的实验中利用一根光纤作为力传感器，DNA分

6、子一端连接在光纤上，另外一端连接在小球上，小球通过吸力作用被固定在一个微吸液管上。移动微吸液管，DNA分子就被拉伸，光纤因此发生偏移，通过一个位置敏感的光敏二极管检测传送的激光束信号来记录光纤偏移的位置。DNA拉伸在Smith等的实验中，两个小球分别连接到DNA分子的两端，一个小球由微吸液管控制，另外一个小球由光镊子控制。光镊子不仅能“钳住”小球，也能作为力传感器，因而能够测量作用力的大小。移动微吸液管，两小球之间的距离变大，DNA分子被拉伸，因此得到力．延伸曲线。DNA拉伸原理：双链DNA分子的弹性对分子的螺旋很敏感。利

7、用一个能在连接点处阻止旋转的分子基团(如引人多个生物素和digoxygenin基团)，旋转DNA分子，DNA分子扭曲，因而能对DNA分子的弹性与扭曲张力之间的关系进行详细的研究。在这类实验中，一般使用在连接点处连接磁性小球，然后用旋转磁铁诱导旋转¨。DNA扭曲相应的分子构造包括三处不同的连接位点(分别用生物素、digoxygenin和荧光素修饰)和一个起旋转作用的单链缺口；一个转子小球连接到DNA分子中央生物素标记处；转子小球由流动力(fluidflow)固定在一个地方,当旋转吸液管时,扭转的张力就在DNA上面部分积聚；撤

8、去流动力,转子小球转动,释放出扭曲张力。转子小球的角速度跟扭矩成正比。能够测量双链DNA分子的扭转系数；能测量酶对DNA作用产生的扭矩。DNA凝聚DNA凝聚对于亲代细胞准确分裂成两个子代细胞来说是必须的，因为压缩状态的DNA比处于展状态的DNA更容易分裂。不同外界因素也能够诱导DNA凝聚，如多胺(精胺和