MTT法检测细胞活性并绘制生长曲线综述.doc

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1、MTT法检测细胞活性并绘制生长曲线综述关于选择MTT法检测睾丸支持细胞细胞数H并绘制生长曲线综述李锦阳作者简介:李锦阳，男，大学本科，学生摘要:目的：绘制睾丸支持细胞的生长曲线，确定其对数增长期准确时间范围，确定出最适宜染毒时间。方法：MTT法大致检测活细胞数目，根据细胞数H绘制睾丸支持细胞生长曲线。关键词:MTT生长曲线睾丸支持细胞细胞增殖前言:20世纪60年代以来，随着组织培养技术的不断完善和细胞系(株)的不断建立，利用细胞系(或原代细胞)进行离体细胞生物测量的方法随之出现。细胞计数是离体细胞测量培养并绘制细胞生长曲线的基础，也是细胞培养技术中一项耗费

2、时间精力比较大的步骤。曝卩坐蓝法(3-4,5diemethylthiazol-2,5dipheuyltetrazoliumbromide,MTT)是TimMosman(1983)首创的一种利用比色测定活细胞量的方法，由于该法灵敏准确、经济简便因而被广泛应用于生物学和医学研究中，现在许多实验采用MTT进行细胞计数，测量细胞生长曲线，大大提高了细胞计数的效率。冃前国内外研究睾丸支持细胞生长曲线的报道尚属少见，因此目前为止，无法准确获悉睾丸支持细胞的体外细胞培养的对数期。而细胞增殖的对数期是细胞染毒的最佳时期，确定了睾丸支持细胞的增殖对数期将会大大方便今后的研究

3、工作者。原理:四卩坐盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTTo活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚飒能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，经过换算，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。方法：①配置MTT溶液：称取250mgMTT,放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min,用0.22um的微孔滤器除菌,分装，4°C保存备用，两周内冇效。②接种细胞：将已经制成细胞悬液的睪丸支持

4、细胞和其屮混杂的生精细胞计数，使Z达到每孔1000-10000的细胞浓度接种与96孔培养板中（每孔体积200ul）,按照观察期限7天，共计分装7个板（注意每隔48小时左右换液一次，避免细胞因营养物消耗完毕影响生长，造成测定误差）③培养细胞：将培养板移入C02孵箱中，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养。④呈色：以接种细胞开始，每隔24小时取出一板，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul,37°C孵箱中继续孵育4h,终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150ulDMSO缓慢十字振荡lOmin,使结晶物充分溶解。⑤比色：选择490nm波长，在酶

5、联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。小结目前细胞增殖检测方法常用的有MTT法,3H・TdR（氟胸腺"密噪核昔）标记法、BrdU(5■漠脱氧尿卩密唳核昔)ELISA法、CCK-8等，MTT法具有简便、经济、安全等特点但操作繁琐需要加入DMSO溶解甲蹶颗粒，而且往往因溶解不全而对实验结果造成影响3H-TdR掺入法虽然灵敏度搞、特异性强、稳定性好，但是其操作步骤多，存在放射性危害等问题而被限制使用。近年来发展起来的一种新型检测方法CCK-8(countingkit・8),其原理为活细胞线粒体脱氢酶转发的黄色结晶

6、为高度水溶性，不需要裂解细胞，可以直接闭塞，操作简单，准确性相对有所提高。有实验表明，CCK-8灵敏度高于MTT法，而且细胞可以重复利用，大大减少了工作量，其实用性较MTT法高，预计在以后的科学研究屮将会一步步取代MTT法广泛用于细胞计数。本实验选择MTT法计数睾丸支持细胞并据此绘制其生长曲线，一是MTT法被使用近三十年来，是科学研究中最为广泛选取的方法，具有可靠性和经济性。参考文献：侯春梅,MTT和CCK-8法检测悬浮细胞增殖的比较。周思朗，SRB法与MTT法细胞计数应用比较。胡珊，MTT法测定几种农药组合联合作用初探。何国龙，MTT法测定异搏定联合化疗

7、药物对胶质瘤细胞U251化疗敏感性评估苏秀莉，MTT法检测香叶木昔对脐静脉内皮细胞增殖抑制的影响杜伟伟，MTT检测肾疏宁含药血清对大鼠腹膜间皮细胞的作用熊建文，MTT法和CCK-8法检测细胞活性之测试条件比较吴窈画，MTT法检测细菌细胞数的主要影响因素分析刘苹，MTT法与BrdUELISA法检测成纤维细胞增殖的可靠性比较朱文菁，MTT法分析培养成骨细胞的存活和增殖能力赵斌，小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法