Qubit4.0使用与维护SOP教学内容.doc

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1、Qubit™4.0荧光计的使用与维护标准操作规程1.目的检测核酸建库效果，作为核酸建库的质量控制措施。2.适用范围适用于检测核酸和蛋白的含量。3.职能用于建库及DNB制备相关的实验员检测核酸或蛋白质。4.内容4.1仪器型号ThermoFishQubit™4.0Fluorometer4.2检测原理:Qubit™4荧光仪定量检测核酸，其原理是基于特定荧光染料与所检测的核酸靶分子结合。这些荧光染料只有与这些靶分子结合时才会发射荧光信号，即使在浓度很低时。Qubit™4.0荧光定量仪比传统的紫外吸光法更加准确。紫外吸光法不具有选择性，测量26

2、0nm所有分子的吸光值，包含DNA、RNA、蛋白质、游离核苷酸或多余的盐离子。此外，紫外分光光度计的灵敏度不足，无法完成低浓度DNA和RNA的精确定量。使用Qubit™4荧光定量仪，将大大提升准确性。因为Qubit™4分析试剂盒里的荧光染料只与样品中的特异分子结合——DNA、RNA或蛋白，避免不准确测量带来的重复工作。 4.3检测操作:4.3.1使用要求：（1）请勿在阳光直射下操作仪器。（2）处理样品时戴无粉手套。（3）仅在室温（22-28℃）下使用仪器。（4）在室温下保存所有的试剂盒，仅在Qubit™4荧光计测定荧光时才插入分析管。

3、（5）在测量之前请勿用手握住分析管。（6）测量前仪器已经用适当的校准品校准过。（7）将样品或标准品与工作液混合之后，让Qubit™DNA和RNA分析管孵育2min。（8）将样品或标准品与工作液混合之后，让Qubit™蛋白分析管孵育15min。（9）如果要多次读取同一支管，请从仪器中取出分析管，让其平衡至室温30s，再进行下一次读取。（10）不建议多次读取RNA样本。4.3.2配置工作液：（1）在主界面上选择试剂计算器计算出配置Qubit™工作液所需的染料和缓冲液的量。（2）输入将在Qubit™4荧光仪上运行的样本数和标准品数量。可选：

4、如果您想在计算的总容量中包含一个额外的管，请按下“超额”复选框。（3）按Enter计算配置Qubit™工作液所需的Qubit™染料和缓冲液的量。注意：在此屏幕上可以更改计划检测的管数或超额选择。（4）按Done返回主界面运行Qubit™检测。4.3.3标准品校准：（1）从试剂盒里取出标准品standard1,2，在主界面选择要读取新标准的检测类型。要进入可用于检测的第二页，请将屏幕向右滑动。要返回第一页，将屏幕向左滑动。（2）选择所需的检测方法（3）点选试验，如果第一次选择会直接提示进行校准，如以前进行过校准，则会提示使用以前的或新进

5、行校准。若要将先前的校正应用于样本读数，请按下“运行样本”。这里选择进行校准。（4）出现下面界面，将试剂盒中用于校准的标准品1#放入样品室，点击“Read standard”，大约3秒，读取完成进入到下一步，放入标准品2#，点击“Read standard”（蛋白质校准还需放入标准品3#）。（5）在读取标准品2#后（或读取标准品3#后），校准就完成了。如果校准成功,软件显示读取标准的屏幕,显示荧光与浓度图。（6）荧光与浓度图:标准数据点被一条线连接。（圆圈表示正确的标准）如果校准失败，会显示“校准错误”，需重新进行校准。（7）如果用于

6、RNAIQ检测：检测成功，软件将显示准备好样本信息。如果校准失败,会显示“校准错误”。（8）如果收到“校准错误”消息，需要重新运行校准。在弹出错误的屏幕中，按“OK”。查看Read标准屏幕。如果希望重新运行标准或运行新的标准，按Read标准，然后重复校准过程。（9）检测RNAIQ，可以根据校准错误重新运行特定的校准。错误消息提供了如何纠正校准错误的指导。4.3.4样品检测（1）将品与反应液混合（混合方案具体见试剂盒）孵化一段时间（DNA和RNA为2min,蛋白质需要15min）。（2）在Readstandard（用于Qubit™定量分

7、析）或Readyforsamples界面，按Runsamples。（3）在样本量屏幕中，选择用于Qubit™定量分析或Qubit™RNAIQ检测的样本体积和单位。在方向盘上按+或-按钮选择检测管中样本体积（1-20ul），从下拉菜单中选择输出样本浓度的单位。在RNAIQ检测中，没有相关的单位，只选样本检测体积。（4）将样品管插入到样品室，关上盖子，然后点击读取管。定量分析大约需要3秒，质量分析需要5秒。（5）在屏幕上就会显示所检测的浓度。（6）多个样品检测：a.相同体积和浓度单位：只需更换样本室中样本管，点击读取。b.不同体积和浓度单

8、位，更改体积和浓度单位重复上述步骤。4.3.5数据读取：（1）如果结果在检测范围内，则显示浓度值。顶部的数值（大体字）是原始浓度。底部的数值为稀释后浓度（插入Qubit™4荧光计的样品管中样品浓度）。检测浓度存在一定范围