gateway重组技术讲课讲稿.doc

《gateway重组技术讲课讲稿.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、Gateway基因克隆Gateway基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。这一技术在插入的目的DNA片段两端整合attL1和attL2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（GatewayEntryClone）。据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可

2、逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（GatewayCloningTechnology）。一、Gateway基因克隆的原理及机制Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（EntryVector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（De

3、stinationVector，目的载体）上。Gateway的原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方

4、向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。图1、噬菌体位点专一性重组的机制在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入

5、门载体以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。同样，目的载体（DestinationVector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。 当需要将目的基因从入门载体（EntryVector）转移到目的载体（DestinationVector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的

6、LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。attL1序列再和attR1序列重组，融合质粒分解为两个新的质粒，目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发生重组置换，得到一个带目的基因的目的载体（生成新的重组位点attB1、B2）和带自杀基因的入门载体（生成新的重组位点attP1、P2，见图2）。由于带自杀基因的载体不能生长，加上抗生素筛选，转化产物重组率高达90%以上。图2、gateway机制由于在这个反应中attL1序列只和attR1序列重组，attL2序列只能与attR2序列重组，

7、这个方向的反应称为LR反应。LR反应生成新的位点称为attP1/2（200bp）和attB1/2（25bp）序列。在一定的条件下，attP和attB序列也能发生重组，生成attL和attR序列，这个反向反应称为BP反应（见图3）[1]。图3、BP反应及LR反应 当用户得到一个含目的基因的Gateway表达载体，希望将目的基因转移到另外几个Gateway表达载体中时，只要先将目的基因从Gateway表达载体中转移到入门载体上，在由入门载体转移到其它的表达载体就行。将含目的基因的Gateway表达载体（attB1—目的

8、基因—attB2序列）与带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列的供体载体（pDONR，注意这个载体不同于入门载体EntryVector）混合，加入含有Int、IHF的BP重组酶混合物，attP和attB序列也能发生重组，生成带有目的基因的入门载体（EntryVector）和带自杀基因的表达载体。同样，由于抗性不同以及自杀基因的作用，只有含目的基