实验十二--DNA的限制性内切酶酶切分析.doc

《实验十二--DNA的限制性内切酶酶切分析.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验十二DNA的限制性内切酶酶切分析课程名称：生物化学与分子生物学实验课年级：2006专业、层次：临床医学本科　　　　　　授课教师：许成山职称：讲师　　　　　　学时：4学时基本教材：自编《生物化学与分子生物学实验指导》教学目的与要求：1、实现DNA的体外重组，鉴定Bcl-2重组质粒中的插入片段。2、学会设计构建体外重组DNA分子，根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶以及DNA的酶切技术。大体内容与时间安排：1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理10min2、DNA琼脂糖凝胶电泳的操作过程（录像）5min3、EcoRⅠ酶切操作步骤的改动注意事项5min4、学生做实验

2、140min教学方法：讲授式+启发式教学重点、难点：重点：1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理2、DNA限制性内切酶酶切分析的注意事项难点：DNA限制性内切酶酶切分析的原理5一、实验原理（一）EcoRⅠ酶切重组质粒Bcl-2的原理：限制性内切酶(restrictionendonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物

3、学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成RE酶切位点的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。实验可选用价格低廉、酶切效果好的EcoRⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切，观察RE的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp片段。本实验是将实验十制备的人Bcl-2重组质粒DNA作为EcoRⅠ酶切底物。人Bcl-2重组质粒是EcoRⅠ单酶切的pBluescript

4、ⅡKS(-)载体与EcoRⅠ单酶切的人Bcl-2cDNA重组而成的，大小为4861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2961bp的质粒载体。因此用EcoRⅠ酶切则应得到空载pBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2cDNA(1.9kb)两个片段。经琼脂糖凝胶电泳后可较容易鉴定鉴定该质粒中的插入片段。（二）琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的

5、DNA可与荧光染料SYBRGreenI结合，在紫外灯下可看到亮绿色荧光条带，籍此可分析实验结果。5二、操作步骤1、取Eppendorf管一支，在管中按下表依次加入：组分体积消毒三蒸水2.5μl10×bufferH1.5μl质粒  DNA10μlEcoRⅠ（4U/μl）1μl反应体系：15μl2、加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应1h。3、制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表。表琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系凝胶中的琼脂糖含量[%(w/v)]线性DNA分子的有效分离范围(kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～7

6、1.20.4～61.50.2～32.00.1～2称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓冲液60ml，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀。4、灌胶(1)取洁净的电泳内槽(又称托盘)，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好(一定要封严，不能留缝隙)。(2)将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。(3)将冷却至60℃5左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。(4)待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。(5)加入1×TAE缓冲液至电

7、泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。5、加样剪取适当大小的蜡膜(Parafilm膜)，取6×荧光上样缓冲液2μl点于膜上数点。取5μl酶切后的样品，0.5～1μg未酶切质粒DNA，DNA分子量标准分别与荧光上样缓冲液混匀。将其分别加入凝胶的点样孔(记录点样顺序及点样量)。6、电泳接通电源槽与电泳仪的电源(检查正负极，DNA片段是从负极向正极移动)。DNA的迁移率与电压成正比，电压不超过5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿1～2cm处，切断电源，停止电泳。7、观察结果取出内槽