绵羊肺腺瘤病毒的分子生物学技术检测.pdf

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1、分类号S852.21学校代码10129UDC619学号08201061绵羊肺腺瘤病毒的分子生物学技术检测DetectionofexogenousJaagsiekteSheepRetrovirusbymolecularbiologytechniques申请人：赵泽赟学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：动物生理学指导教师：刘淑英教授论文提交日期：二〇一一年五月摘要本研究设计了巢式RT-PCR、半巢式RT-PCR、斑点杂交三个试验，来准确、敏感的检测绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiektesheepretrovirus

2、JSRV）。通过在外源性绵羊肺腺瘤病毒的囊膜基因env的TM区和长末端重复序列LTR的U3区分别设计特异性的巢式、半巢式引物以及特异性的探针，运用巢式、半巢式RT-PCR、斑点杂交的方法进行检测、比较，同时也与普通RT-PCR进行比较。结果表明，巢式RT-PCR测得的绵羊肺腺瘤病毒的env基因和U3区序列与GenBank中发表的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列的同源性分别为96%和98%，半巢式RT-PCR的同源性为96.8%和98%。特异性试验结果表明本研究设计的env基因和LTR的U3区的巢式、半巢式引物不能从健康绵

3、羊、小鼠、家兔的肺组织以及感染了绵羊肺腺瘤病病羊的肾、肝、脾的RNA中扩增出条带。斑点杂交同样也不能从健康绵羊和小鼠的肺组织得到阳性的蓝色斑点。敏感性试验结果表明，env基因和LTR的U3区的巢式、半巢式RT-PCR诊断方法最低能检测出的标准模板RNA量分别为48fg和48pg以及0.48pg和480ng，而普通的RT-PCR，env基因及LTR的U3区的最低检出量分别为0.48ng和4.8ng，得出巢式RT-PCR的敏感性高于普通RT-PCR，而半巢式RT-PCR的env基因敏感性高于普通RT-PCR的env基因，

4、但是LTR的U3区敏感性却低于普通的RT-PCR，同时巢式RT-PCR的敏感性高于半巢式RT-PCR。斑点杂交env基因及LTR的U3区的最低检出量分别为74.58pg和0.7458ng，从这三个试验敏感性结果得出巢式RT-PCR的敏感性最高，同时在这三个试验中env基因的敏感性高于LTR的U3区的敏感性。以上试验说明巢式RT-PCR技术对于检测绵羊肺腺瘤病具有很高的敏感性和实用性，但是斑点杂交具有操作简单，快速的优点，同时敏感性也较高，在试验条件不充足时，可能实用性会更强。关键词：绵羊肺腺瘤病；exJSRV；巢式R

5、T-PCR；半巢式RT-PCR；斑点杂交DetectionofexogenousJaagsiekteSheepRetrovirusbymolecularbiologytechniquesAbstractTodetectJaagsiektesheepretrovirusaccuratelyandsensitively,thisstudywasdesignedthreeexperimentssuchasnestedRT-PCR,hemi-nestedRT-PCRanddotblotingtodetectthem.Pair

6、sofspecific-primersandspecific-probesoftheexJSRVenvgeneandU3sequencesweredesignedforthenestedRT-PCR,thehemi-nestedRT-PCRanddotbloting,todetecttheOPAandcomparethesethreemethods.TheresultsshowedthatthehomologyofenvgeneandU3ofthenestedRT-PCRwere96%and98%respective

7、lyandthehemi-nestedRT-PCRwere96.8%and98%,comparedwiththeexogenousJaagsiekteSheepRetroviruspublishedinGenBank.Asdemonstratedbythespecificitytest,theprimersofthenestedRT-PCRandthehemi-nestedRT-PCRdesignedinthepresentstudycouldnotbeamplifiedfromthelungRNAofhealthy

8、sheep,miceorrabbits,aswellasthekidney,liverorspleenofSPAsheep.ThespecificityresultsofthedotblotingalsocouldnotbedetectedfromthelungDNAofhealthysheepandmice.Thelowestvalueofs