TcLr24小麦抗叶锈病相关基因的分离与功能分析.pdf

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1、分类号：曼垒三主：12l：盟密级：纽单位代码：巡学号：2QQ22ZTcLr24小麦抗叶锈病相关基因的分离与功能分析IsolationandFunctionalAnalysisofDisease--ResistanceRelatedGenestoWheatLeafRustfromTcLr24学位申请人：张立荣指导教师：杨文香教授刘大群教授学科专业：植物病理学学位类别：农学博士授予单位：河北农业大学答辩日期：--O----年五月二十九日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文

2、中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑童垦盔些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：；够彦受签字日期：p，，年J月z尸日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑兰垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰堡盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授

3、权书)学位论文作者签名：害易劫尊签字日期：yI．年r月矽日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：扣坪{j__；签字日期：^，，年，月‘哆日电话：邮编：摘要ⅢIIIIllllIlllIlllIIlY1897563由小麦叶锈菌(Pucciniatriticina)引起的小麦叶锈病是一种在世界范围内普遍流行的气传性病害，严重威胁小麦生产。选育并合理利用抗病品种是防治麦类锈病危害最经济、安全、有效的途径之一。因此，利用和发掘抗叶锈资源，延长品种的抗叶锈性寿命，成为小麦叶锈病防治的一项任务。本研究选择当前在我国抗性较好的小麦抗叶锈病近等基因系TcLr24为研

4、究对象，应用同源序列法和cDNA．AFLP技术对其进行抗病相关基因的研究，利用荧光实时定量PCR进行表达分析，同时利用BSMVVIGS技术对基因进行了初步的功能验证。主要结果如下：l根据已克隆植物抗病基因NBS保守结构域设计引物，从携带小麦抗叶锈病基因Lr24的回交6代近等基因系材料TcLr24中获得了1个通读的小麦抗病基因同源片段RGAJ。该片段含有NB-ARC保守结构域，具有抗病基因NBS特征结构域(P环、激酶2、激酶3a等)。2以获得的RGAJ片段为靶序列，利用RACE技术获得了2822bp的TcLr24cDNA全长RGAJ。RGAJ包含2397bp的开放阅

5、读框，编码799个蛋白质氨基酸序列，RGAJ编码产物具有NBS、LRR等抗病基因保守结构域，与多个己知植物抗病基因的功能相应区域一致。Southern杂交结果表明，其在TcLr24基因组中为单拷贝。实时荧光定量PCR对RGAJ基因的表达情况研究表明，该基因为组成型表达。BSMVVIGS功能验证没有发生表型改变。3本研究利用cDNA-AFLP技术筛选了84对引物能够在小麦近等基因系TcLr24和感病对照Thatcher之间揭示出多态性，根据基因表达与否以及表达量，获得了9种不同差异表达的多态性条带类型，分别代表了不同状态下测试材料的表达状况。4成功克隆和测序了121

6、个差异表达片段(Transcript．derivedfragments，TDFs)，测序结果在NCBI上应用BLASTx比对进行推导的蛋白质序列的相似性分析，结果共有32条为功能已知的同源序列，占总数的27％；比对上功能未知的序列37条占总数的30％；没有比对上的序列45条占总数的37％。已知功能序列的TDFs涉及初级代谢、转运相关、抗病与防御、转录相关、信号传导相关、细胞结构、能量代谢、蛋白储运等。5从差异表达并测序的片段中选取了9个进行荧光实时定量PCR分析，证实了这些基因差异表达是由于叶锈菌诱导表达的结果，发生在小麦与叶锈菌互作的早期。与cDNA．AFLP表

7、达基本一致，说明利用cDNA．AFLP分析基因的表达是可靠的。6利用RACE的方法获得了3个激酶基因，包括TaSTK(1475bp)，TaRLPK(2398bp)，TaLRRK(2038bp)，分别编码丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶(408aa)，类受体激酶(656aa)，LRR-受体激酶(595aa)。InterProScan分析表明，它们所编码的蛋白都具有典型的蛋白激酶的核心区域，属于激酶类基因，并且这三个蛋白的磷酸化作用需要依赖ATP。经Psort预测显示，TaSTK编码的蛋白最可能分布在叶绿体基质中，几率为85．4％，而TaRLPK和TaLRRK编码的蛋白分布在质

8、膜中的可能