小麦——叶锈菌互作过程中钙调素下游蛋白的筛选.pdf

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1、白的筛选ScreeningofCaMInteractingProteininprocessofwheatleavesinvadedbyleafrustfuocessOteatleayesfungi‘学位申请人：周慧指导教师：王冬梅教授学科专业：植物学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学、答辩日期：二。一一年五月三十一日(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签名：签字Et期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：摘要细胞内Ca2+浓度的瞬时升高是触发植物防御反应的早期

2、信号。钙调素(Calmodulin，CaM))作为一类最重要的Ca2+结合蛋白可以通过与其下游CaM结合蛋白(Calmodulinbindingprotein，CaMBP)作用而调节细胞的生理功能，所以鉴定和分析病原体激发的CaMBP将有助于理解Ca2+_CaM信号调节的防御反应机制。因此，对CaMBP的研究是揭示CaM作用机制的重要内容，是探明Ca2+．CaM信号转导系统的关键。本实验室以小麦．叶锈菌互作体系为研究对象，通过钙信使阻断或激活药物试验、钙离子的亚细胞定位、激发子刺激抗病性不同的小麦品种叶肉细胞原生质体后胞质Ca2+

3、变化的研究，证明Ca2+参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的信号转导过程，并且通过实时定量PCR和Westernblotting以及抑制性差减杂交技术发现在不亲和互作早期，小麦CaM表达量升高，初步证明小麦CaM也参与了这一过程。为进一步探讨CaM在小麦抵抗叶锈菌侵染的信号转导过程中的功能和作用机理并寻找与之相互作用的蛋白，本文以小麦钙调素基因CAM2-3及CAM4-1构建诱饵载体，用MatchmakerLibraryConstruction&ScreeningKits在小麦受叶锈菌侵染后构建的酵母双杂交cDNA文库中寻找与CaM发生蛋白．

4、蛋白相互作用的基因，得到了8个阳性克隆。经测序分析，其中408与水稻类乙烯诱导钙调素结合蛋白(ethylene．inducedcalmodulin-bindingprotein4．1ike)的C端同源性很高，暂时命名为TaCAMTA．1ike(calmodulin-bindingtranscriptionactivators．1ike)。通过双分子荧光互补技术(Bimolecularfluorescencecomplementation，BiFC)验证了所筛选出的TaCAMTA．1ike蛋白在烟草细胞中也能与CaM发生相互作用，且

5、它们之间的相互作用即可在细胞质中进行也可在细胞核中进行；对TaCAMTA．1ike蛋白氨基酸序列进行分析，找到了TaCAMTA-Like可能与CaM相互作用的位点，通过电泳迁移率变化分析试验进一步证明了该位点与CaM的相互作用。在此基础上，利用RT-PCR检测了该基因在小麦接种叶锈菌后在转录水平的变化，结果表明在接种后的不亲和组合中TaCAMTA-Like的表达量高于模拟接种，且在接种后4-48h均保持较高水平的表达，在接种后72h其表达量下降并与对照相近；而亲和组合中TaCAMTA—like的表达量在48h之前与对照相比并无明显

6、变化，72h略有下降。初步表明其参与了小麦抗叶锈菌侵染的过程。上述结果对深入开展TaCAMTA．1ike基因的功能研究、深入探讨和完善小麦抵抗叶锈菌侵染过程中CaM信号转导通路奠定了基础。关键词：钙调素；钙调素结合蛋白；酵母双杂交；双分子荧光互补技术ScreeningofCaMInteractingProteininprocessofwheatleavesinvadedbyleafrustfungiCandidate：ZhouHuiSupervisor．ProfessorWangDong-meiSpecialty：．CellBio

7、logyAbstractTheincreaseofintracellularCa虹ansientwastriggeredbyearlysignsofplantdefenseresponses．Calmodulin(CAM)，aubiquitousCa+sensorproteinminterissensitiveandCanrespondtotheinstantaneousriseofCa2+，Ca2+／CaMisoneofthemostintensiveandwideinvestigationsintheplantcellsign

8、altransduction．CaMbindsitsdownstreamCalmodulinbindingprotein(CaMBP)regulatecellphysiologicalfunction．Identificationandanalys