中和试验步骤.doc

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1、中和试验步骤1、测定病毒TCID50/100µl2、制备细胞悬液，使细胞浓度约为1×105个/mL，加到96孔细胞培养板中，每孔100µl。置37℃CO2培养箱中，直至细胞长至单层。3、血清灭活：将待检测的血清放到56℃水浴30min（此时血清中的病原菌都已被灭活）。4、100TCID50/50µl病毒液或者200TCID50/25µl病毒液的制备，这两者是等价的。100TCID50/50µl病毒液制备方法：计算已测定了TCID50/100µl的病毒原液稀释至100TCID50/50µl的稀释倍数:lg100TCID50/50µl=-log100-log(100/50)=-2.3010

2、3得100TCID50/50µl=10-2.30103，假设病毒TCID50/100µl=10-6.3，则稀释倍数=(100TCID50/50µl)÷(TCID50/100µl)=106.3÷102.30103≈9976倍。5、取一块新的96孔板，1-10列每孔加50µl待检血清原液，再用8道孔排枪加每孔100TCID50/50µl病毒液50µl，稍微吹打使血清与病毒液混均。11列先每孔加50µl维持液，再于11列的第一孔加50µl标准阳性血清，将标准阳性血清往下作1:2、1:22至1:28倍稀释。12列第1孔加标准阴性血清原液50µl，再加100TCID50/50µl病毒液50µl。

3、用维持液将100TCID50/50µl的病毒液作4次连续10倍稀释，稀释成10TCID50/50µl、1TCID50/50µl、0.1TCID50/50µl,依次加到第12列的3到6孔，每孔加50µl，再每孔加50µl维持液。将培养板置37℃CO2培养箱中和1h。1、将细胞长至单层的培养板中的维持液倒掉，然后将上一步已中和1h的血清病毒液转移到长了单层细胞的培养板中，转移的时候要小心，以免加的液体把细胞吹掉了。2、再每孔加150µl维持液，微量振荡器上震荡30s，混均。将培养板置37℃CO2培养箱中，96h后开始观察记录结果。(注：在第5步中，加血清和抗原的时候，加的体积最好大于50µ

4、l，不然第6步将中和的血清病毒液转移到单层细胞上的总体肯定是小于100µl的。加了维持液后，最后的总体积是250µl。)