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时间:2020-08-31
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1、免疫共沉淀详细步骤实验原理当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行
2、的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。实验试剂1.RIPABuffer配制:基础成分:Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白
3、;用H2O配制成10%储存液;避光保存)注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH7.4)亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20
4、℃保存)RIPA磷酸(酯)酶抑制剂激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见SodiumOrthovanadateActivationProtoco)NaF(200mM的储存液,室温保存)注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂2.工作液配制:配制100ml的modifiedRIPAbuffer: 1)称取790mg的Tris-Base,加到75ml去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4 2)加10ml10%的NP-40 3)加2.5ml10%的去氧胆酸钠,搅拌,直
5、到溶液澄清 4)加1ml100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存 5)理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100μl;PMSF,Na3VO4,NaF各500μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。各种成分在工作液中的终浓度: Tris-HCl:50mM,pH7.4 NP-40:1% 去氧胆酸钠:0.25% NaCl:150mM EDTA:1mM PMSF:1
6、mM 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂:各1μg/ml Na3VO4:1mM NaF:1mM实验步骤准备工作:预冷PBS,RIPABuffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机1.用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;2.加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶);3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上);4.4
7、℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中;5.准备ProteinAagarose,用PBS洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠;6.每1ml总蛋白中加入100μlProteinA琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景;7.4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除ProteinA珠子;8.(Bradford法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,
8、以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月);9.用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μl,以降低裂解液中去垢剂
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