注射用重组人白介素-2(I).doc

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1、注射用重组人白介素-2（I）ZhusheyongChongzuRenBaijiesu-2（I）RecombinantHumanInterleukin-2(I)forInjection本品系由高效表达人白细胞介素-2(125Ser)[简称人白介素-2(125Ser)]基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。1基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。2制造2.1工程菌菌种2.1.1名称及来源重组人白介素-2(125Ser)工程菌株系由带有人白介素-2(125Ser)基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株，其中人白介素

2、-2基因序列中原125位编码半胱氨酸的序列被突变为编码丝氨酸的序列。2.1.2种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。2.1.3菌种检定主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。2.1.3.1划种LB琼脂平板应呈典型的大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。2.1.3.2染色镜检应为典型的革兰阴性杆菌。2.1.3.3对抗生素的抗性应与原始菌种相符。2.1.3.4电镜检查（工作种子批可免做）应为典型的大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。2.1.3.5生化反应应符合大肠杆菌生物学性状。2.1.3.6人白介素-2表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量

3、。2.1.3.7质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。2.1.3.8目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。2.2原液2.2.1种子液制备将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。2.2.2发酵用培养基采用适宜的不含任何抗生素的培养基。2.2.3种子液接种及发酵培养在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜的温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录ⅪG）。2.2.4发酵液处理用适宜的方法收集处理菌体。2.2.5

4、初步纯化采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。2.2.6高度纯化经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，即为人白介素-2(I)原液。加入适宜稳定剂，除菌过滤后保存于适宜的温度，并规定其有效期。2.2.7原液检定按3.1项进行。2.3半成品2.3.1配制与除菌2.3.1.1稀释液配制按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。2.3.1.2稀释与除菌将检定合格的含稳定剂的人白介素-2原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。除菌过滤后即为半成品，于2-8℃保存。2.3.2半成品检定按3.2项进行。2.4成品2.4.1分批应符合“生物制品分批

5、规程”规定。2.4.2分装及冻干应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。2.4.3规格应为经批准的规格。2.4.4包装应符合“生物制品包装规程”规定。3检定3.1原液检定3.1.1生物学活性依法测定（附录ⅩD）。3.1.2蛋白质含量依法测定（附录ⅥB第二法）。3.1.3比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×107IU。3.1.4纯度3.1.4.1电泳法依法测定（附录ⅣC）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。3.1.4.2高效液相色

6、谱法依法测定（ⅢB）。色谱柱以适合分离分子质量为5～60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0及适宜的表面活性剂；上样量应不低于20μg，于波长280nm处检测，以人白介素-2色谱峰计算理论板数,应不低于1500。按面积归一化法计算，人白介素-2主峰面积应不低于总面积的95.0%。3.1.5分子量依法测定（附录ⅣC）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，分子质量应为15.5kD±1.655kD。3.1.6外源性DNA残留量每1支应不高于10ng（附录ⅨB）。3.1.7宿主菌蛋

7、白残留量应不高于总蛋白质的0.10%（附录ⅨC）。3.1.8残余抗生素活性依法测定（附录ⅨA），不应含有残余氨苄西林或者其他抗生素活性。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.01%进行测定。3.1.9细菌内毒素检查每300万IU应小于10EU（附录ⅫE凝胶限量试验）。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025%再进行测定。3.1.10等电点主区带应为6.5～7.5,供试品的等电点与对照品的等电点图