苹果霉菌的分离与纯化.doc

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1、从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用沙堡琼脂培养基28℃培养2-3天，分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离，挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行载片小培养，经28℃培养2—3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。观察到簇生在分生孢子梗的顶端的呈帚状分枝的分生孢子和有隔菌丝，可鉴定为青霉类菌；观察到分生孢子梗上呈轮状着生、具有3个分隔、弯曲的孢子，可鉴定为弯孢霉类菌；观察到单细胞的芽殖孢子，并通过进一步的酵母菌生理生化测定，可鉴定为酵母菌。2材料2.1病料发了霉的红薯、酸败腐烂的苹果2.2培养基2.2.1沙堡

2、琼脂培养基成分：蛋白胨10克、麦芽糖40克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升2.2.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基成分：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升2.2.3保存琼脂培养基成分：蛋白胨10克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升2.3器材无菌室、手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、锥形瓶、漏斗、试管、烧杯、胶头滴管、石蕊试纸、接种环、酒精灯、量筒、玻璃棒、纱布、滤纸、试管塞、报纸、扎绳、标签、温箱、冰箱、盖玻片、载玻片、显微镜、杜氏管3方法3.1真菌的分离培养3.1.1实验的准备沙堡琼脂培养基的制备：用天平称取蛋白胨1

3、0克、麦芽糖40克、琼脂20克，用量筒量取蒸馏水1000毫升置烧杯中混匀，在电炉上加热熔化，加热过程中不断用玻璃棒搅拌，调整PH值至5.4，倒入锥形瓶中，115℃灭菌20分钟，倾注平板，冷却[1]。无菌室、接种箱的清洁：用酒精棉球将接种箱的内部全部擦洗干净，放入试管架、酒精灯、标签、接种环、笔、火柴等实验用具放入接种箱内，密封接种箱。依次打开接种箱与无菌室的紫外灯，紫外线灭菌20分钟。3.1.2划线分离培养：在酒精灯火焰下进行以下操作（1）从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用28℃培养2-3天，分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离，挑

4、取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）进行载片小培养，经28℃培养2-3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。（2）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开20度左右的角度（角度越小越好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染）。划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。（3）右手持接种环，将上述霉变物分区划线接种于沙堡琼脂培养基平板中，划完前一个区域后将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后与前一区域的最后一两条折线接触划出第二区域，依次类推，共划三到四个区域。划线中不宜过多的重复旧线，以免形成菌苔。（

5、4）接种完毕，在皿底上作好日期，平皿倒扣，置28℃培养2-3天。（5）将分离培养得到的几个分离株用沙堡琼脂培养基重新进行平板划线分离，以得到纯的单一的菌落。3.2真菌的载片培养（小培养）3.2.1实验的准备马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的制备：将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（注意：发霉、变绿的不要使用。）切成薄片或蚕豆大小的方块，称取所需的重量，倒入锅内，加水1000mL煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻棒不断搅拌，以免烧焦锅底。再加入事先用温水溶化的糖溶液，用二层纱布

6、过滤。测定pH值，用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL[2]。无菌室、接种箱的清洁：同2.1.1。无菌水的制备：取5-6mL蒸馏水装入10mL小试管中，塞上棉塞，用报纸包装好，115℃高压灭菌20分钟。3.2.2实验的操作取直径7cm左右的圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部，上放一个U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖，进行灭菌[3]。为防止培养过程中培养基干燥，特在滤纸上滴加无菌水3-4mL，挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，震荡试管制成孢子悬液。用灭菌滴管吸取灭菌

7、后熔化的固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿内的载玻片中央，并用接种环将孢子悬液接种在培养基上，然后盖上盖玻片，用镊子轻轻压一下，最后盖上平皿盖,即成为载片小培养[4]。3.3真菌的保存3.3.1保存琼脂培养基的制备取蛋白胨10克、琼脂20克、蒸馏水1000毫升至烧杯中混匀，在电炉上加热融化，调整PH值至5.4，分装试管，115℃灭菌20分钟，摆成斜面[5]。无菌室及接种箱的清洁：同2.1.13.3.2实验操作将划线分离培养28℃2-3天的平板从温箱取出，放入无菌室中进行以下的操作：在无菌室中靠近酒精火焰处，从平板培养基上选取可疑菌落，用接种环轻轻刮取其表面

8、的少许孢子，拉出接种环立即伸入斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部从斜面